2019-2020年宁夏炭疽芽胞杆菌毒力鉴定及基因分型研究

杨 聪，高建炜，马江涛，海 娥，邹 悦，陈丽莉，李小璐，韩 坤，张术斌

炭疽是由炭疽芽胞杆菌引起的一种人兽共患传染病。主要传染源为牛、羊、马等食草动物，人因接触患病动物而被感染[1]。宁夏是炭疽自然疫源地，自2014年以来疫情呈现上升趋势，且疫源地面积较广，防控难度逐渐增大[2]。有研究发现炭疽芽胞杆菌的致病力与其毒力因子有关，当菌体中具有毒力因子即可判定为强毒菌株[3]。由于炭疽芽胞杆菌遗传进化相对保守，导致其基因缺乏遗传多样性，目前常用的基因分型技术主要有可变数目串联重复序列(multiple locus variable-number tandem repeat analysis, MLVA)和单核苷酸多态性(canonical single nucleotide polymorphism, canSNP)两种，对揭示菌株的遗传进化特征具有重要意义[4]。为了解宁夏炭疽芽胞杆菌的致病力和基因分型特征，揭示菌株间的遗传特征及基因型别，本研究对2019-2020年宁夏各地区分离到的炭疽芽胞杆菌进行了相关试验研究，以期为疫情溯源提供线索和科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 本研究所用菌株为2019-2020年本实验室收集保存的临床分离菌株，共分离到4株炭疽芽胞杆菌，全部分离自患者皮肤渗出液(表1)。

表1 2019-2020年宁夏临床分离炭疽芽胞杆菌菌株信息Tab.1 Background information on strains of B. anthracis in Ningxia from 2019 to 2020

1.2 试验材料 Tag DNA聚合酶、无菌水、DNA Marker2000购自全式金生物有限公司；核酸提取试剂盒(QIAGEN DNA Mini Kit)购自德国QIAGEN公司；血琼脂平板、营养琼脂购自青岛海博生物有限公司。MLVA-15各位点引物由上海生工生物公司合成；SNP探针及引物由中国疾控中心传染病所提供；ABI7500Fast荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.3 方 法

1.3.1 菌株基因组DNA的提取 按照QIAGEN试剂盒步骤提取。

1.3.2 毒力鉴定 采用文献报道的4个毒力因子位点[5]设计引物(表2)。反应体系为25 μL：含Tag DNA聚合酶12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板3 μL，无菌水7.5 μL。扩增参数为：95 ℃预变性5 min； 95 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃ 延伸1 min， 30个循环；72 ℃延伸5 min。

表2 毒力因子引物序列信息Tab.2 Information on primer sequences for virulence genes

1.3.3 MLVA-15分型 将分离到的菌株提取核酸后，采用参考文献[6]报道的引物序列和PCR方法扩增菌株的15个可变重复序列(VNTR)位点。PCR扩增反应体系为20 μL：含Tag DNA聚合酶10 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，无菌水6 μL。扩增参数为：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s，72 ℃1 min，34个循环；72 ℃延伸5 min。其中vrrB1、vrrB2位点退火温度为55 ℃，VNTR12、VNTR16、VNTR 17、VNTR 35位点退火温度为52 ℃，其余反应条件均相同。将扩增为阳性的样品送往上海生工生物公司进行测序。

1.3.4 canSNP分型 根据文献[6]报道的炭疽芽胞杆菌的13个SNP位点，使用TaqMan探针法对菌株的核酸进行检测。建立20 μL扩增体系，包含：Tag DNA聚合酶10 μL，上下游引物及探针各0.4 μL，DNA模板1 μL，无菌水7.4 μL。扩增条件为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，45个循环；40 ℃ 30 s。使用荧光定量PCR仪7500FAST进行扩增。根据所检测到的荧光信号，对照探针序列，确定所检测的SNP位点是哪一种核苷酸。

2 结 果

2.1 炭疽芽胞杆菌毒力鉴定情况 通过对分离到的4株炭疽芽胞杆菌基因组DNA经普通PCR扩增，结果显示在900 bp、923 bp、373 bp和1 242 bp处分别出现目标条带(图1)，由此可判定这4株炭疽芽胞杆菌均为强毒菌株。

A：扩增Lef基因；B：扩增Pag基因；C：扩增Cap基因；D：扩增Cya基因注：M为2 kb DNA Marker；5、11、17、23为阴性对照；6、12、18、24为阳性对照；其余胶孔为检测样本。图1 2019-2020年炭疽芽胞杆菌毒力基因PCR产物电泳图Fig.1 Detection on virulence genes of B. anthracis by PCR

2.2 MLVA-15分型 通过对分离到的4株炭疽芽胞杆菌基因组DNA进行MLVA-15分型，结果显示4株炭疽芽胞杆菌在15个VNTR多态性位点处的扩增产物大小均相同(表3)，属于同一个种群，结果提示该种群菌株可能是宁夏的主要流行菌群。

表3 2019-2020宁夏炭疽芽胞杆菌VNTR位点扩增产物Tab.3 Amplification results of the VNTR locus of B. anthracis in Ningxia from 2019 to 2020

2.3 canSNP分型 通过对分离到的4株炭疽芽胞杆菌基因组DNA进行canSNP分型，并与文献比对位点的变异情况(表4)，结果显示4株炭疽芽胞杆菌均为A.Br.001/002型，是我国最常见的SNP基因型。

3 讨 论

炭疽是一种严重的人兽共患自然疫源性传染病，呈现世界范围内流行。不仅能使人和动物发病甚至死亡，还是一种潜在的生物战剂，可引起严重的公共卫生问题[7]。人感染炭疽，根据感染途径不同，可分为肺炭疽、肠炭疽和皮肤炭疽，其中皮肤炭疽最为常见。宁夏是皮肤炭疽疫情高发省份之一，据记载自1958年起就有病例报告，2004-2018年平均报告发病率高于全国[2]；且宁夏地处西北内陆高原，有天然的草场，牛羊养殖贸易发展迅速，周边省份均有皮肤炭疽疫情，存在疫情输入的风险，因此，宁夏皮肤炭疽疫情防控压力和难度较大。虽然有针对宁夏皮肤炭疽流行特征及炭疽芽胞杆菌的实验室检出情况的报道[8-10]，但缺乏对引起皮肤炭疽疫情的病原菌的致病力强弱及基因分型方面的研究。

炭疽芽胞杆菌的基因组是由1个环状染色体和2个质粒(PXO1和PXO2)组成，主要致病因子位于这2个质粒上。当炭疽芽胞杆菌同时具有这两种毒性质粒时，菌体就会有很强的致病力，一旦失去其中一个因子，致病力会随之下降[11]。本研究发现2019-2020年分离到的4株炭疽芽胞杆菌均为强致病力的菌株，且分离到菌株的患者临床症状较为严重[12]。推测菌株致病力的强弱可能与患者临床症状具有一定的相关性。

炭疽芽胞杆菌在外界环境中可形成芽胞从而导致菌株的遗传学性状较为稳定，而细菌学常用到的随机扩增多态性DNA分子标记技术及脉冲场凝胶(PFGE)电泳分子分型技术仅能鉴定到种属间的差异[13]。目前常用于炭疽芽胞杆菌基因分型的方法主要有MLVA和canSNP两种。其中MLVA分型方法证明可用于鉴别炭疽之间的差异及多样性，通过区分基因组上不同串联重复序列(VNTR)的重复数鉴别菌株，是较好的分子分型方法之一[14]。且有学者对我国北方省份106株临床分离的炭疽芽胞杆菌进行了MLVA-15分型，共分成36个基因型，极大的丰富了我国炭疽芽胞杆菌基因型别[15]。本研究运用MLVA-15分型技术对2019-2020年宁夏分离到的炭疽芽胞杆菌杆菌进行基因分型，虽然菌株来源于不同县区不同年份，但结果表明4株分离菌株属于同一个种群，提示菌株间存在流行病学关联。canSNP是一种在地理分布上进行溯源的基因分型方法[4]。据报道中国境内的炭疽芽胞杆菌共分为5种canSNP型别，分别为A.Br.001/002、A.Br.008/009、A.Br.Vollum、A.Br.Aust.94和A.Br.Ames。本研究结果显示2019-2020年分离到的4株的炭疽芽胞杆菌canSNP型别为A.Br.001/002型，此种型别在贵州、云南、陕西、内蒙古等地方均有分布，是我国最为常见的SNP基因型[16-19]。

本研究对2019-2020年宁夏分离的炭疽芽胞杆菌菌株进行了初步的毒力鉴定及基因分型研究，了解了宁夏炭疽芽胞杆菌致病力及分子遗传特征。由于菌株分离率较低，用于实验研究的样本和来源较为局限，应当对更多的菌株进行基因分型研究，用于揭示宁夏炭疽芽胞杆菌的基因型别和分子流行病学特征，为本地炭疽疫情的预警和防控提供更全面的实验室数据。虽然宁夏皮肤炭疽目前处于较低的散发水平，但由于疫源地消毒效果不明、农民防控意识淡薄、牲畜交易控制难度较大等原因，宁夏皮肤炭疽疫情仍然存在扩散传播的风险。因此，今后应提升实验室检测能力，提高炭疽芽胞杆菌的分离率并加强分子生物学检测溯源工作，为更好的控制疫情提供有力保障。

利益冲突：无

引用本文格式：杨聪，高建炜，马江涛，等. 2019-2020年宁夏炭疽芽胞杆菌毒力鉴定及基因分型研究[J].中国人兽共患病学报，2022，38(5)：447-450，457. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.060