高压热杀菌技术灭活细菌芽胞机理研究进展

申 瑾， 郭家俊， 陈 翔， 吴 珊， 包军鹏， 章 中

(宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021)

1 HPTS技术简介

高压热杀菌技术(High-pressure Thermal Sterilization，HPTS)是指将静态超高压和热耦合起来用于杀菌，通常所用压力为400～900 MPa，通常所用温度为50～90 ℃。HPTS杀菌技术比传统热杀菌技术的热处理强度低，可以生产出质量更高的食品[1]。随着消费者对天然、新鲜、安全和最少加工食品的需求日益增长，HPTS引起了人们极大的兴趣。HPTS是一种新兴的生产货架稳定、低酸食品的技术，能灭活细菌芽胞，并使食品具有较好的感官和营养品质[2]。目前，HPTS还没有广泛地应用于食品工业中，部分原因是由于其杀灭细菌芽胞的机理尚不为人知。

2 芽胞对食品保藏与安全的影响

芽胞是细菌营养体在缺乏营养的环境条件下形成的休眠态，可以休眠几万年以上而复活，对各种杀菌处理(如辐照、超高压、热、超声波、微波、化学物质等)有最强的耐受能力。在食品工业中，常因为杀菌强度不够而发生由芽胞导致的食品腐败和食物中毒问题[3]。高抗性芽胞的杀灭是低酸性食品安全的一个关键问题[4]。芽胞萌发后迅速生长而引起低酸性食品腐败。有数据显示，每年有35%的果汁污染与嗜酸芽胞杆菌有关, 欧洲果汁协会2011年的调查发现,45%的果汁生产企业发生过脂环酸芽胞杆菌污染引起的腐败事件[5]。美国佛罗里达州市售的180种热带和亚热带的水果浓缩汁中,6.1%的样品存在脂环酸芽胞杆菌污染现象[6]。有报道分析了新西兰乳业超过10年的数据,证实乳粉中嗜热芽胞的数量有时<10 个/g,有时可>105个/g，对乳粉造成了很大损害[7]。同时芽胞也在对人体造成危害，芽胞杆菌和梭状芽胞杆菌的芽胞可导致多种食源性疾病，从轻微的呕吐到危及生命的毒素中毒。据报道地衣芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌与某些食源性疾病的暴发有关[8-9]。

3 细菌芽胞的结构及其杀菌抗性

芽胞的极端杀菌抗性与其特殊结构紧密相关[8,10-12]。芽胞的结构与其营养体非常不同。芽胞从外到里有七层结构，分别是孢外壁、芽胞衣、外膜、皮层、细胞壁、内膜、内核[13]。孢外壁是芽胞的最外层，由碳水化合物和蛋白质组成，不同类型的芽胞，孢外壁的大小差异很大，而且这层结构与芽胞的抗性没有任何作用[14]。芽胞衣主要由蛋白质构成，它使得芽胞对许多化学物质有抗性，也能保护芽胞免受外源皮层裂解酶的攻击。芽胞衣之下是外膜，它之下是芽胞的皮层(cortex)。皮层占芽胞体积36%～60%，皮层的渗透压为2.0 MPa左右，含水量70%，略低于营养细胞(80%)，但比芽胞整体的平均含水量高出许多,芽胞的皮层对其抗压性有关键影响。皮层之下是芽胞的细胞壁，由肽聚糖构成，接下来是芽胞的内膜，它是完整的，是生长中的细胞胞质膜的类似物，具有很强的渗透性屏障，阻碍了损伤DNA的化学物质进入，芽胞萌发后内膜成为营养体的细胞膜。

芽胞内核的一个重要生物化学特性就是其水分含量极低，仅有25%～50%，而营养体细胞水分含量为80%左右，芽胞核心含水量低是导致其休眠和耐热性的关键因素之一[11]。皮层通过挤压核心来促进水分的流失，这伴随着DPA的积累。芽胞中的DPA含量高，DPA含量约占内核干重的20%，其钙盐是细菌芽胞杀菌抗性的原因之一[15]。小分子酸溶性蛋白(Small acid-soluble protein, SASP)占芽胞内核总蛋白的3%～6%。缺乏a/β SASP的突变芽胞对紫外线、热、过氧化物、电离辐射和其他杀菌处理的敏感性提高。

4 HPTS对细菌芽胞的杀灭作用

4.1 HPTS对细菌芽胞的杀灭效果

Ahn等[16]报道了HPTS处理下牛奶中嗜硬脂热芽胞的数量减少了6个对数值。Ates等[17]报道HPTS(650 MPa、65 ℃、10 min)能杀灭4.5个对数的枯草芽胞杆菌芽胞。Evelyn等[18]报道HPTS处理下牛肉泥中蜡样芽胞杆菌芽胞减少了4.9个对数值。Evelyn等[19]研究了芽胞对热、高压热处理和单独热处理的抗性差异的比较发现HPTS(600 MPa、75 ℃)处理蜡样芽胞杆菌芽胞具有显著效果。Izabela等[20]发现在300 MPa、50 ℃、15 min条件下处理苹果汁，能有效杀灭苹果汁中的酸土脂环酸芽胞杆菌芽胞，且苹果汁浓度会影响杀灭效果。随着杀菌压力和温度的升高，芽胞萌发和失活也在增强。L. Reverter-Carrióna等[21]发现在压力为200、300 MPa，温度为50、70 ℃都能有效杀灭芽胞。Maier MB等[22]报道HPTS(600 MPa,100 ℃)处理下肉毒梭状芽胞杆菌减少了6个对数值。

4.2 HPTS处理下细菌芽胞灭活动力学

预测HPTS灭活芽胞的数学模型可以让制造商预测和控制食品的安全性和货架稳定性。Zhu等[23]研究了HPTS杀灭生芽胞梭状芽胞杆菌PA3679芽胞的动力学，对于压力从700 MPa到900 MPa、温度为80 ℃时，D值为15.8到7.0 min。Gao等[24]研究了食品成分对HTPS处理下嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞死亡程度的影响，建立了二次模拟方程来预测食品成分和pH值对HPTS处理下芽胞死亡的影响。得出大豆蛋白质、豆油等和食品的pH值能显著地影响该菌芽胞对HPTS的抗性。Silva等[25]用一阶Bigelow模型很好地描述了HPTS对酸土脂环酸芽胞杆菌芽胞的杀灭效果。Wang等[26]报道嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞对HPTS的耐受力比凝结芽胞杆菌芽胞强，Log-logistic模型对芽胞死亡曲线的拟合效果最好，Weibull模型次之。Luu-Thi等[27]报道HPTS(300～600 MPa、60～100 ℃)能杀灭蜡样芽胞杆菌芽胞，HPTS处理下芽胞死亡初期较快、后期较慢，但两个阶段均可用一级动力学模型描述。Evelyn等[28]报道HPTS(400～600 MPa、70 ℃)能杀灭牛奶中的蜡样芽胞杆菌芽胞，Weibull模型能很好地描述芽胞死亡动力学。Uchida[29]报道HPTS(600 MPa、65 ℃)能杀灭酸土脂环酸芽胞杆菌芽胞，随着芽胞悬浮液中可溶性固形物浓度升高，杀菌动力学曲线的D值增大。

5 HPTS杀灭芽胞的机理

目前，HPTS对细菌芽胞的良好杀灭作用已得到公认，但对HPTS杀灭芽胞的机理尚不完全明确。当前主要有两种观点，第一种观点认为HPTS直接破坏了芽胞结构或钝化了芽胞的酶，从而杀灭芽胞。第二种观点认为HPTS先导致芽胞萌发，芽胞萌发后失去极端抗性而被杀灭。

5.1 HPTS直接破坏芽胞结构或钝化芽胞内源酶

曾庆梅等[30]研究了HPTS对枯草杆菌芽胞超微结构的影响，采用透射电镜进行观察，观察结果表明：超高压处理后枯草芽胞杆菌的营养体细胞壁皱缩，出现缺口，胞浆泄漏，结构层次感消失，出现大片透电子区；其芽胞外壳被破坏，出现缺口，芽胞内含物结构紊乱，泄漏，出现部分透电子区，甚至内含物质完全泄漏，出现细胞壁或孢子外壳残留，芽胞大量被杀灭。高瑀珑等[31]采用比色法研究了HPTS对枯草芽胞杆菌与嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞的影响，结果表明，HPTS处理芽胞能够显著提高芽胞DPA的泄漏率(P<0.05)，能够破坏芽胞的结构，芽胞内膜通透性屏障被破坏，显著提高了芽胞DPA的泄漏率，实验结果说明HPTS杀灭枯草芽胞杆菌与嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞的原因可能是其物理结构被破坏。刘洁等[32]使用了HPTS处理芽胞，研究了连续式施压和间歇式施压两种不同方式对枯草杆菌芽胞的灭活作用。结果表明，经扫描电镜观察，芽胞外壳出现凹陷、皱褶等形态变化，这种间歇式的施压产生强烈的机械剪切力，造成芽胞结构损伤及内容物的泄漏，甚至死亡。Black等[33]研究高压和nisin对牛乳中芽胞杆菌芽胞萌发和灭活的共同作用，经过透射电镜观察，发现HPTS处理后，芽胞的结构有明显损坏，出现凹陷和空洞，并且核心内容物似乎不存在。2013年章中等人研究乙醇协同HPTS处理后枯草芽胞杆菌芽胞，通过透射电镜观察发现，未经处理的芽胞光滑且圆润，皮层清晰，皮层和芽胞核区都没有电子透射区，在HPTS 处理后，有些芽胞的皮层被水解，芽胞内出现了大面积的电子透射区，芽胞被压垮，芽胞的核心出现紊乱。Wang等[34]研究高压和微酸性电解水对蜡样芽胞杆菌芽胞结构的影响，采用扫描电镜、透射电镜、超分辨多光子共聚焦显微镜等研究了芽胞的生理反应，结果表明，HPP-SAEW处理蜡样芽胞杆菌，芽胞形态有部分损伤，芽胞壁不完整，芽胞表面有不规则的突起，甚至有严重的变形。芽胞的杀灭主要是不依赖于萌发，而是直接被杀灭。Akasaka等[35]首次将高分辨率高压核磁共振光谱应运于枯草芽胞杆菌芽胞悬浮液中，并直接实时监测了DPA在 200 MPa、20 ℃压力下的泄漏过程。发现在200 MPa、20 ℃下，三分之一的DPA立即泄漏，其余的只有在减压时才缓慢泄漏，而且一旦DPA从内核中耗尽，在80 ℃左右，它们的蛋白质很容易变性，且芽胞衣、内外膜和皮层等芽胞特有结构基本被破坏，从而导致芽胞失活。

5.2 HPTS导致芽胞萌发而被杀灭

芽胞萌发是指在某种条件下芽胞从休眠态转变成营养体细胞的过程。芽胞一旦萌发后杀菌抗性就会大大降低[36-38]。Setlow[39]报道芽胞萌发被划分为两个阶段，第一阶段会有阳离子释放、DPA释放、芽胞核心的部分水化、部分杀菌抗性的散失。第二阶段会有皮层的水解、芽胞核心的进一步水化、芽胞核心的膨胀、杀菌抗性的完全散失。两阶段完成后，芽胞的新陈代谢开始恢复，SASP被降解，大分子物质开始合成，新的营养体细胞从芽胞衣中脱离出来。很多报道称芽胞萌发过程中杀菌抗性的散失与以下因素有关，即DPA的释放、芽胞内膜通透性的增加，SASP的降解和皮层的水解等。

5.2.1 HPTS处理下芽胞DPA释放导致其萌发进而被杀灭 许多报告认为DPA释放是在HPTS条件下灭活细菌芽胞的关键步骤。Paidhungat等[40]发现550 MPa的压力处理打开了芽胞DPA的释放通道而导致芽胞萌发。Margosch等[41]研究了细菌芽胞的杀菌抗性，得出在600～800 MPa和60 ℃以上的温度下，DPA主要是通过物理化学过程而不是生理过程释放的，发现HPTS处理下芽胞的灭活和DPA的释放密切相关。Clery-Barraud等[42]将突变衍生体RP42菌株的炭疽杆菌芽胞暴露于HPTS处理下(280～500 Mpa、10～360 min、20～75 ℃)，测定芽胞的失活动力学，研究表明，HPTS能完全杀灭炭疽杆菌芽胞，可能是HPTS处理下DPA释放，而诱导了芽胞萌发，萌发后的炭疽杆菌芽胞杀菌抗性降低。Black等[43]发现枯草芽胞杆菌芽胞在500 MPa、50 ℃下能快速萌发，这个过程是通过超高压直接引起DPA的释放，随后引起芽胞的萌发而不是通过作用于芽胞的营养萌发受体引起芽胞萌发。得出诱导芽胞释放DPA并萌发的最佳温度约60 ℃。并推测VHP可能作用于芽胞内膜而导致DPA释放，但作用靶点尚不明确。黄娟等[44]以凝结芽胞杆菌芽胞、嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞为研究对象，研究了HPTS的对其失活、萌发、损伤方面的影响，研究表明，当较低压力(≤300 MPa)和初温(≤60 ℃)时能有效诱导两种细菌芽胞的萌发；当较高压力(≥500 MPa)和较高温度(≥80 ℃)时，两种芽胞的失活率趋于接近。此外，对比常压热处理与HPTS处理对芽胞的不同影响发现，HPTS对芽胞的萌发、失活影响明显大于常压热处理，但热仍是造成芽胞损伤的一个重要因素。Vercammen等研究了HPTS对番茄酱中凝结芽胞杆菌和脂环酸芽胞杆菌芽胞萌发和失活的影响，发现在600～800 MPa下, 芽胞的萌发与温度关系极大, 在60 ℃时，在所有处理压力和时间条件下观察到芽胞灭活，并且灭活程度几乎等于萌发程度。Reineke等[45]通过研究芽胞特有物质DPA释放和芽胞热敏感性增加的情况，认为HPTS杀灭芽胞的机制涉及三个步骤：①休眠②激活③杀灭。随着处理强度的增加，芽胞的灭活程度大大增加，当压力超过一定阈值时，温度成为影响芽胞萌发的主导因素。Hofstetter等[46]对HPTS与reutericyclin或Nisin联合处理下嗜热杆菌芽胞内膜流动性进行了原位测定。结果表明，在不改变内膜高度有序状态的情况下，芽胞可以被HPTS灭活，而且，reutericyclin 和Nisin对芽胞内膜流动性的不同影响有助于研究HPTS诱导芽胞释放DPA和失活。Erika Georget等[47]采用原位红外光谱(FT-IR)和荧光光谱法研究了硬脂酸杆菌芽胞在HPTS处理下萌发和失活的机理，芽胞内膜用 Laurdan 荧光染料染色。在HPTS处理下，原位记录了红外光谱和荧光光谱。发现在200 MPa和55 ℃条件下，芽胞DPA快速且全部释放，HPTS导致了芽胞萌发，萌发率可达3个对数值，从而杀灭芽胞。Robert Sevenich等[48]采用平板计数法、高效液相色谱法和流式细胞仪(FCM)检测HPTS处理对DPA释放、芽胞灭活及芽胞内膜的影响，发现DPA的释放对HPTS处理下的芽胞失活至关重要，DPA的释放是芽胞灭活的限速步骤，而芽胞内膜可能是HPTS作用于芽胞的靶结构。

5.2.2 HPTS导致芽胞内膜通透性增加而被杀灭 芽胞萌发时其内膜通透性会增加。HPTS会导致芽胞内膜通透性增加而将其杀灭，主要是由于HPTS处理下水分子穿透内膜屏障并进入芽胞内核，使芽胞的抗性降低而将其杀灭。Mathys等[49]使用流式细胞仪研究了HPTS对地衣芽胞杆菌芽胞的杀灭机理,采用SYTO16和碘化吡啶对HPTS处理后的芽胞进行染色, 研究芽胞内膜通透性变化, 提出了一种包含三个步骤的HPTS杀灭芽胞机理, 依次为芽胞皮层水解和芽胞萌发、一个未知步骤、芽胞内膜被破坏而失活。Zhang等[50]研究了HPTS结合不同浓度乙醇对枯草芽胞杆菌芽胞的杀灭作用。乙醇协同HPTS处理后芽胞的内膜通透性大大增加并严重受损，随着乙醇浓度的提高和水分的减少，HPTS杀灭芽胞的效果降低，进一步表明水分子进入芽胞内核对HPTS杀灭芽胞有至关重要的作用。章中[51]通过透射电镜观察HPTS处理前后的枯草杆菌芽胞，发现未经HPTS处理的芽胞内核颜色很深、内容物致密紧凑，而经HPTS处理的芽胞内核颜色变浅，这个现象说明经HPTS处理后，芽胞内膜水分子通透屏障受损，水分子进入芽胞内核，发生了水合现象。Sevenich等[48]用氯化钠和蔗糖调节芽胞悬浮液的水分活度，发现随着水分活度的降低，水分通过芽胞内膜进入芽胞内核的量越少，HPTS对芽胞的灭活能力下降。Rozali等[52]采用扫描电镜对HPTS处理前后芽胞的形态进行观察，发现芽胞具有不可逆的体积和形状变化。细菌芽胞的失活被认为是从芽胞内膜受损开始的，而芽胞内膜通透性的增加会促进芽胞内核DPA的释放和含水量的增加，进而导致芽胞死亡。

5.2.3 HPTS导致芽胞SASP降解或皮层水解而杀灭芽胞 SASP是一个多基因族的产物，这个多基因族仅在出芽后期表达。SASP仅存在于芽胞的核心，占芽胞总蛋白含量的5%。SASP的关键功能是和芽胞DNA结合在一起，这种结合使得芽胞DNA更为稳定并免受许多物理损害，芽胞萌发后期SASP会降解[53]。芽胞的皮层主要由肽聚糖构成，在芽胞萌发早期就被降解。目前认为HPTS处理下芽胞皮层肽聚糖水解机理仅有两种可能性, 其一是HPTS激活皮层裂解酶, 其二是HPTS导致皮层肽聚糖的非酶水解。在休眠的芽胞中, 皮层裂解酶不表现出活性, 但在芽胞萌发而转变成营养体的过程中, 皮层裂解酶通过某种机制被激活并将皮层肽聚糖水解, 然后导致芽胞核心的完全水化，这是芽胞萌发过程中的一个重要步骤[13]。Mathys等[54]认为,HPTS处理下芽胞内部的DPA的释放可能会激活皮层裂解酶, 从而将芽胞皮层水解, 进而导致芽胞死亡。Reineke等[55]报道HPTS很可能会影响皮层裂解酶的活性, 在某些压力和温度条件下, 皮层裂解酶可能会被激活, 导致芽胞皮层水解而萌发, 进而使得芽胞结构被破坏。章中[51]研究乙醇协同HPTS处理后枯草杆菌芽胞的透射电镜观察，高浓度的乙醇抑制了芽胞皮层裂解酶的活性，皮层肽聚糖未能被水解，而肽聚糖水解是芽胞萌发的一个关键步骤，这一步骤被抑制导致芽胞萌发过程受阻，乙醇协同HPTS处理下芽胞仍然有抗热抗压性，其内部结构受影响小，不易被HPTS杀灭。

6 展 望

HPTS能杀灭食品中的所有微生物，包括最难被杀灭的细菌芽胞，使得食品能在常温下长期贮藏，和传统高温热杀菌相比，HPTS使用的温度较低、时间较短，能更好地保持食品原有的色、香、味、质构、营养素和功能性成分，受到国内外食品科学家的广泛关注。细菌芽胞需要高强度的杀菌处理以确保食品安全和保藏效果，芽胞的杀灭是食品杀菌的关键任务。HPTS作为一种新型杀菌技术，其优点鲜明，然而其杀灭芽胞的机理却远不够清楚，研究报道较少。HPTS仍会对食品的营养和感官品质造成一定的影响，加深对HPTS杀灭芽胞机理的理解可有利于降低这种不利影响。通过研究，希望在杀灭食品中各种芽胞的同时尽可能地保持食品原有的营养和感官品质。

目前对HPTS杀灭细菌芽胞机理的研究主要集中在处理前后芽胞结构和关键物质的变化上，而对芽胞结构和关键物质在HPTS处理下的实时动态变化研究少之又少。芽胞内膜通透性屏障的损伤是HPTS杀灭芽胞的一个关键原因，未来我们可以采用金刚石对顶砧技术结合拉曼光谱法、傅里叶变换红外光谱法、落射荧光单分子显微术、荧光分光光度法、X射线衍射、核磁共振等技术，以芽胞内膜磷脂大分子为研究切入点，通过实时动态研究HPTS处理下芽胞内膜磷脂分子侧向热运动、相态和分子间氢键作用的变化规律，从多个层次和不同角度阐明HPTS微物理场中芽胞内膜流动性变化的原因，最终揭示HPTS微物理场中芽胞内膜水分子通透屏障受损的分子机理，进一部夯实HPTS杀菌技术的理论基础，推动HPTS技术在食品工业中的应用。