杭州市1 731株结核分枝杆菌耐药状况分析

黄银燕，吴亦斐，贾庆军，程庆林，方子健，谢 立

结核病(Tuberculosis，TB)是全球十大死亡原因之一，主要是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染引起，以潜伏期长，致死率高为主要特征。2020年全球约有987万人感染结核病，发病率为127/10万,较往年有所减缓。2015-2020年结核病发病率累计下降了11%，但未达到WHO提出的2020年终止结核病策略的要求。各国结核病流行的严重程度差异较大，30个结核病高负担国家占全球所有估算发病率的86%，其中最严重的8个国家：印度(26%)、中国(8.5%)、印度尼西亚(8.4%)、菲律宾(6.0%)、巴基斯坦(5.8%)、尼日利亚(4.6%)、孟加拉国(3.6%)和南非(3.3%)，占总数的2/3。2020年所有新发病例中，成年男性患者占56%，成年女性占33%，儿童占11%。2020年全球新发耐多药结核病(multi-drug resistance tuberculosis，MDR-TB)和利福平耐药结核病(Rifampicin resistance tuberculosis，RR-TB)患者有132 222例，广泛耐药(extensively drug-resistant，XDR)患者有25 681例[1]。

我国是结核病高负担国家，根据世界卫生组织2021年的统计数据， 2020年估算的结核病新发患者数为84.2万(2019年为83.3万)，估算发病率为59/10万(2019年为58/10万)，占全球总结核病患者的8.5%,仅次于印度[1]，较2019年略有上升。结核病的防控形势依旧严峻，耐药结核病防控形势也不容乐观，2019年全球新发耐药结核病患者中我国占14%，仅次于印度[2]。

研究显示，杭州市的结核病患者耐药率2011年是31.3%[3]，2015年是22.3%[3]，2017年是20.1%[4]，耐多药率2011年是11.6%[3]，2015年是8.0%[3]，2017年是3.74%[4]，均呈下降趋势。本研究对2018年1月至2019年12月分离自杭州市周边7个县区的1 975份诊断为肺结核病人的培养菌株进行药物敏感性实验和菌种鉴定，分析这些地区耐药结核病的流行状况，优势耐药谱，不同地区间耐药率的比较，初治和复治病人耐药状况，以及结合前几年的研究数据，比较初治和复治病人耐药率的变化趋势，为提供更有效的耐药结核病防控策略提供依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源 菌株来自2018年1月至2019年12月杭州市余杭区、萧山区、富阳区、临安区、建德市、桐庐县、淳安县结核病定点医院肺结核病人的痰培养阳性标本。痰培养按照《结核病实验室检验规程》[5]分离分枝杆菌，酸性罗氏培养基购自杭州市创新生物技术有限公司。

1.2 分枝杆菌菌种鉴定 菌种鉴定采用硝基苯甲酸和噻吩-2-羧酸肼生长实验,具体操作参照文献[5-6]。在噻吩-2-羧酸肼培养基上生长，而硝基苯甲酸培养基上不生长，则为人型结核分枝杆菌(Mycobacteriatuberculosis)，在两种培养基上都不生长，则为牛型结核分枝杆菌(Mycobacteriabovis)，均属于结核分枝杆菌复合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTBC)。在两种培养基上均生长，则为非结核分枝杆菌(Nontuberculous mycobacteria，NTM)，硝基苯甲酸和噻吩-2-羧酸肼培养基购自珠海贝索生物技术有限公司。

1.3 分枝杆菌药物敏感性实验 分枝杆菌药物敏感实验按照《结核病实验室检验规程》[5]采用比例法进行操作。液体培养的结核分枝杆菌转种至罗氏培养基，待生长后采用比例法。药物包括异烟肼(Isoniazid, INH)、利福平(Rifampicin, RFP)、链霉素(Streptomycin, SM)、乙胺丁醇(Ethambutol, EMB)、氧氟沙星(Ofloxacin, OFX)、卡那霉素(Kanamycin, KM)，培养基药物终浓度依次为0.2 μg/mL、40 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、2 μg/mL、30 μg/mL。具体操作参照文献[5-6]，INH、SM、RFP、EMB购自杭州市创新生物技术有限公司，OFX、KM购自珠海贝索生物技术有限公司。

1.4 相关定义 一线抗结核药物包括异烟肼、利福平、利福喷丁、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、链霉素。二线抗结核药物包括卡那霉素、氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、乙硫(丙硫)异烟胺、对氨基水杨酸、阿米卡星、卷曲霉素、利奈唑胺、贝达喹啉、德拉马尼、氯法齐明。本研究中使用的一线药物为异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇，二线药物为氧氟沙星、卡那霉素。

耐药类型分为：①单耐药，指仅对1种一线抗结核药物耐药；②一线药物耐药,指对1种或1种以上一线抗结核药物耐药；③多耐药， 指对 1 种以上一线抗结核药物耐药，但不包括同时对 INH 和 RFP耐药；④耐多药结核病， 指至少同时对INH和RFP耐药；⑤广泛耐药结核病，指在耐多药的基础上至少同时对 1 种氟喹诺酮类和 1 种二线注射类抗结核药物耐药；⑥RFP 耐药结核病， 指对 RFP 耐药， 包括对 RFP 耐药的上述所有耐药结核病类型(单耐药、 多耐药、 耐多药、 广泛耐药结核病)[7]。

初治肺结核患者指有下列情况之一者：①从未因结核病使用过抗结核药物治疗的患者；②正进行标准化疗方案规律用药而未满疗程的患者(登记分类以治疗开始时为准)；③不规则化疗未满1个月的患者。复治肺结核患者指有下列情况之一者：①因结核病不合理或不规律服用抗结核药物治疗≥1个月的患者；②初治失败和复发患者[5]。

1.5 统计分析 采用EXCEL软件整理数据，用SPSS 22.0进行统计分析。各组耐药率比较用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 分枝杆菌菌种鉴定结果 1 975份培养菌株中，鉴定为结核分枝杆菌占87.6%(1 731/1 975)，鉴定为非结核分枝杆菌占12.4%(244/1 975)。

2.2 结核分枝杆菌的耐药率 1 731株结核分枝杆菌中，对受试药物全敏感的菌株占81.74%(1 415/1 731)株，18.26%(316/1 731)菌株至少对一种受试药物耐药，其中初治患者总耐药率为17.74%(270/1 522)，复治患者总耐药率为22.01%(46/209)，初、复治耐药率差异无统计学意义(χ2=2.245，P>0.05)。在6种受试药物中，INH的耐药率最高，为10.05%(174/1 731)。其余5种药物耐药率从高到低依次是SM(9.01%)、OFX(4.74%)、RFP(3.24%)、EMB(2.14%)、KM(0.35%)，6种药物的初治耐药率和复治耐药率高低排序不变。1 731株结核分枝杆菌中，14.96%(259/1 731)对一线药物耐药；4.97%(86/1 731)对二线药物耐药；单耐药、多耐药、耐多药、广泛耐药、利福平耐药的耐药率分别是11.84%(205/1 731)、3.81%(66/1 731)、2.60%(45/1 731)、0.06%(1/1 731)、3.24%(56/1 731)。见表1。

表1 1 731株结核分枝杆菌的耐药率Tab.1 Drug resistance rates of 1 731 M. tuberculosis strains

2.3 结核分枝杆菌耐药谱 在28种耐药谱中(表2)，耐2、3、4、5种药的组合中优势耐药谱分别为INH+SM(2.43%)、INH+RFP+SM(0.58%)、INH+RFP+SM+EMB(0.58%)、INH+RFP+SM+EMB+OFX(0.58%)。有1例复治病人对6种药物均耐药。

表2 耐药结核分枝杆菌的耐药谱Tab.2 Drug resistance spectrum of drug-resistant M. tuberculosis

2.4 不同临床特征的肺结核患者的耐药情况分析

1 731例检出结核分枝杆菌病例中，男性1 245例(71.92%)，女性486例(28.08%)，其中男女性患者的任一药物耐药率差异无统计学意义(χ2=0.427，P>0.05)，男性患者耐多药率显著高于女性(χ2=8.423，P<0.05)。从患者年龄层次看，60周岁以上患者有830例，占比最高(47.95%)。不同年龄段对任一药物的耐药率差异有统计学意义(χ2=8.114,P<0.05)，0～20岁患者任一药物耐药率最低(8.1%)；不同年龄段耐多药率差异无统计学意义(χ2=2.417，P>0.05)。见表3。

表3 不同临床特征的肺结核患者的耐药情况分析Tab.3 Analysis of clinical drug resistance of patients with tuberculosis with various clinical characteristics

2.5 不同地区耐药率分析 在7个区县中，临安区总耐药率、初治耐药率最高，富阳区初治耐多药率最高，建德市复治耐药率、总耐多药率、复治耐多药率最高。淳安县总耐药率、初治耐药率最低。萧山区初治、复治、总耐多药率均最低，有4个区县的复治耐多药率都为0。见表4。

表4 2018-2019年杭州市不同地区结核耐药率分析Tab.4 Analysis of TB drug resistance rates in different counties of Hangzhou in 2018-2019

2.6 2011年、2015年、2018-2019年耐药率变化分析 对比2011年、2015年、2018-2019年这3个时间段的数据(表5)，其中，2011年、2015年数据来源于文献[3]。一线药物、RFP、SM的总耐药率、初治患者耐药率及复治患者耐药率以及耐多药、INH、EMB的总耐药率及复治耐药率呈现下降趋势(均P<0.05)。但2018-2019年二线药物OFX的总耐药率和初治患者耐药率较2015年升高(均P<0.05)。

表5 2011年、2015年、2018-2019年杭州市县域结核病人耐药率变化分析Tab.5 Trends in drug resistance prevalence among patients with tuberculosis in suburban Hangzhou in 2011, 2015 and 2018-2019

3 讨 论

世卫组织2020年的统计数据显示，2019年全球新发结核病患者中MDR/RR的占比是3.3%，复治患者MDR/RR的占比是18%，我国的数据分别是7.1%和23%[2]。国内一项回顾性研究显示，2014-2018年的总耐多药率为14.6%[8]。国内其他地区近年的报道显示：贵州的总耐多药率为14.3%[9]；四川的总耐多药率为13.3%[10]；河北的总耐多药率为13.2%[11]；北京的总耐多药率为9%[12]；上海的总耐药多率为5%[13]；陕西省研究965株MTB的耐多药率为6.53%[14]；天津市研究2006—2017年20 212株MTB的耐多药率为12.29%[15]。杭州市2018-2019年初复治患者的MDR/RR均低于全球和全国平均水平。

2011年、2015年、2018-2019年杭州市结核病定点医院收治的结核病人的耐药率呈下降趋势(表5)。复治病人除OFX和KM以外的耐药率均呈下降趋势。2018-2019年初、复治病人对不同药物的耐药率差异无统计学意义(P>0.05)，这在之前的研究中较为少见。杭州市从2016年加入中国国家卫生和计划生育委员会与盖茨基金会结核病防治合作项目三期(中盖结核病三期)，积极推广结核病分子诊断技术，实现了分子诊断技术区县范围全覆盖，使得耐多药结核病的诊断时间从2个月缩短至2 h，大大提高了耐药结核病的诊疗技术，降低了耐药率。上海的一项研究显示，传播是引起耐药结核病的主要原因[16]。另一项研究也显示60%的耐多药病人是传播所致[17]。杭州市开展的DOTS-PLUS项目，为耐药结核病的诊断、管理、治疗提供了新的策略：一方面，从一定程度上阻断了耐药病人的传播；其次，诊断、治疗水平的提升，减少了获得性耐药的发生；再次，杭州市区县定点医院的复治病人比例逐年降低，从2013-2016年的17.22%[18]、2017年的14.37%[4]，下降到2018-2019年的12.07%，随着交通便利，部分复治病人会选择去市级定点医院就医，也是复治病人耐药率下降的一个原因。

对于利福平敏感肺结核的治疗，使用一线抗结核药物治疗。本研究中，4种一线药物耐药率最高的是异烟肼(10.05%)，其次是链霉素(9.01%)，但这两种药物的耐药率2018-2019年相较于2011年和2015年均下降(异烟肼：χ2=52.270，P<0.05；链霉素：χ2=43.003，P<0.05)。这说明目前采用联合用药降低耐药率的方法是有效的。二线药物中氧氟沙星的耐药率高达4.7%，相对于2015年(2.6%)升高(χ2=8.976，P<0.05)。2020版《中国结核病预防控制工作技术规范》[19]关于利福平耐药患者的治疗方案，左氧氟沙星、莫西沙星是首选药物。本研究中，同时耐利福平和氧氟沙星的耐药率为0.81%，而利福平的耐药率是3.24%，即每4个利福平耐药患者中，有1个患者耐氧氟沙星，这个比例值得临床医生关注。

从结核病患者年龄层次看，60岁以上结核病患者占比最大(47.95%)。我国的人口老龄化程度进一步加深，第七次人口普查显示我国60岁及以上人口已超2.64亿，占总人口的18.70%。老年人免疫力下降，基础疾病较多，更易患结核病。这提示我们要重点防控老年人结核病。研究显示不同年龄阶段对任一药物的耐药率存在差异，40～60岁最高，0～20岁最低；而对于任一药物耐药，男女不存在差异，但对于耐多药患者，男性高于女性。江苏连云港的一项研究也显示对任一药物耐药率，28～54岁的最高，0～28岁最低，但性别对于耐药没有差异[20]。

不同地区耐药率分析提示我们要重点关注富阳区，临安区耐药病人的管控。尤其是富阳区初治耐多药率最高，从该区分离的耐多药病人57.14%居住地为同一街道。我们拟对2018年以后分离自富阳区的耐多药结核分枝杆菌进行全基因组测序，从基因组角度进行溯源。 建德市复治耐药率、复治耐多药率较高，提示我们在督导时要重点关注定点医院的诊疗能力和病人的依从性。

利益冲突：无

引用本文格式：黄银燕，吴亦斐，贾庆军，等. 杭州市1 731株结核分枝杆菌耐药状况分析[J].中国人兽共患病学报，2022，38(5)：410-416，422. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.048