马达里亚加病毒TaqMan RT-PCR检测方法的建立

殷启凯,刘文婧,王国玮,张维嘉,付士红,韩 坤,许崇晓,许松涛,李 樊,刘亚宁,何 英, 王振海, 聂 凯, 王环宇

马达里亚加病毒(Madariaga virus, MADV)属于披膜病毒科，甲病毒属，过去被认为是东方马脑炎病毒(Eastern equine encephalitis virus, EEEV)的南美洲分支，又称南美东方马脑炎病毒[1]。东方马脑炎病毒最开始分为4个亚型(Ⅰ～Ⅳ)，Ⅰ型常见于美洲北部，被称为North America(NA)型，Ⅱ-Ⅳ型主要分布于美洲南部和中部，被称为South America(SA)型[2]，由于两者在基因组、生态学和致病机制上具有显著差异，后直接将SA型单独定义为MADV[3]，2020年ICTV将其分类为一个独立的病毒。MADV为直径70 nm左右、表面有纤突的球形包膜病毒，基因组大小约11.7 kb，为单股正链RNA病毒[4]。目前认为MADV的传播媒介主要是库蚊，而且 MADV感染与寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)、登革病毒(Dengue virus, DENV)具有相似的临床表现，往往造成严重的后遗症[2]。近年来，MADV在巴西[5]、海地[2]、巴拿马[6]等拉丁美洲国家时常暴发，虽然我国目前尚未发现MADV的感染与传播，但随着经济全球化进程的推进和国家“一带一路”重大战略的实施，国外媒介传播病原体传入我国的风险日益增高，建立相应的高效快速检测方法日趋迫切。本研究基于TaqMan RT-PCR技术针对MADV建立了早期、快速检测方法，为MADV的检测、监测及相关研究提供实验室支持。

1 材料与方法

1.1 引物、探针的设计与合成 从GenBank中下载MADV的全部序列，通过Clustal X进行多序列比对分析，使用Primer Express(ABI公司，Ver：3.0)选择MADV保守性较高的NSP1区段，根据引物设计原则[7]设计特异性引物及TaqMan探针，引物和探针由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

1.2 MADV RNA标准品的制备 根据多序列比对分析的结果，选择将MADV NSP1基因的保守区(134～208 bp，GI:MH359233.1)克隆至pUC57-Amp载体获得pUC57-MADV质粒(苏州泓迅生物科技股份有限公司)。以线性化的pUC57-MADV质粒为模板进行RNA体外转录(Promega公司，RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System-T7)，RNA产物通过荧光染料法进行浓度定量(Invitrogen公司，QubitTMRNA BR Assay Kit)，根据公式计算拷贝数：单位体积RNA拷贝数(copy/mL)=6.02×1023×RNA浓度(g/mL)/(RNA转录产物碱基数×340)，获得RNA标准品-20 ℃保存备用。

1.3 TaqMan RT-PCR检测体系的建立 建立MADV实时荧光定量检测方法的反应体积为20 μL，其反应体系包括：4×TaqPathTM1-Step Multiplex Master Mix 5μL，(ABI公司，TaqPathTM1-Step Multiplex Master Mix No ROX)，10 μmol/L 的上、下游引物与5 μmol/L 的探针各1 μL，RNA 模板2 μL，无核酸酶水10 μL。配制好的反应体系在CFX96实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad公司)进行扩增，采集FAM通道荧光信号进行检测，根据试剂盒说明书设置扩增反应条件为：25 ℃ 2 min；53 ℃ 10 min；95 ℃ 2 min，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。

1.4 特异性评估 用披膜病毒科甲病毒属盖塔病毒、辛德毕斯病毒，黄病毒科黄病毒属西尼罗病毒、乙型脑炎病毒、寨卡病毒、登革病毒、黄热病毒，布尼亚病毒目Tahyna病毒，呼肠孤病毒科东南亚十二节段RNA病毒属Kadipiro病毒等4科9种虫媒病毒(病毒毒株均来源于本实验室保存)的RNA与MADV的RNA标准品按照建立的检测体系同时进行反应，评估该方法的特异性。

1.5 灵敏度评估 将MADV 的RNA标准品进行10倍梯度稀释，选择8个不同浓度(101～108拷贝/反应)的RNA作为模板进行反应确定该检测方法的灵敏度。使用CFX Manager(Bio-Rad 公司，Ver：3.0)软件，根据各样品的RNA拷贝数(X轴)和实时荧光定量PCR反应Ct值(Y轴)进行计算分析，绘制灵敏度标准曲线。

1.6 重复性评估 以8个不同浓度(101～108拷贝/反应)的RNA样品为模板，每个浓度进行3次平行重复实验，计算每个稀释度的标准差(S)与变异系数(CV)，以评价该检测体系的稳定性。

1.7 不明原因发热病例及蚊虫样本筛查 用建立的TaqMan RT-PCR 检测体系和反应条件筛查2019-2020年宁夏回族自治区、浙江省和云南省的共计81份不明原因脑炎病例急性期血清标本及161批库蚊标本(血清和蚊虫标本均由各省疾控中心经干冰运输至本实验室)，用MADV RNA标准品作为阳性对照，DENV和ZIKV的RNA作为阴性对照，无核酸酶水作为空白对照。

2 结 果

2.1 MADV引物、探针和RNA标准品 GenBank中共有41条MADV序列，根据32条全基因组序列比对分析结果，设计合成MADV NSP1基因特异性引物与探针，其扩增片段长度为75 bp(表1)。经公式换算，RNA标准品的浓度为 1.65×1014copy/mL。

表1 TaqMan RT-PCR检测MADV的引物与探针序列信息Tab.1 Information on primer and probe sequences for TaqMan RT-PCR for MADV detection

2.2 检测体系特异性 利用建立的TaqMan RT-PCR方法将4科9种虫媒病毒的RNA与MADV的RNA同时进行反应，仅MADV的RNA得到成功扩增，其它毒株RNA均无扩增(图1)。

注：1.MADV，2.盖塔病毒，3.辛德毕斯病毒，4. 西尼罗病毒，5. 乙型脑炎病毒，6. 寨卡病毒，7. 登革病毒，8. 黄热病毒，9. Tahyna病毒，10. Kadipiro病毒，11.空白对照。图1 MADV检测体系特异性验证结果Fig.1 Evaluation of the specificity of the TaqMan RT-PCR assay for MADV

2.3 检测体系灵敏度和标准曲线 将8个不同浓度(101～108拷贝/反应)的MADV RNA利用所建方法同时进行检测，最低检测限为1.0×102拷贝/反应，实验数据经CFX Manager软件分析，获得标准曲线方程为Y=-3.925 4X+41.208,R2=0.999 5(图2)。

图2 MADV病毒基因拷贝数定量分析标准曲线Fig.2 Standard curve of the MADV TaqMan RT-PCR assay based on the genomic copy number

2.4 检测体系稳定性 8个不同浓度(101～108拷贝/反应)的MADV RNA各进行3次平行重复实验，各稀释度的Ct值的标准差S均<0.5，变异系数CV值均<1.5%(表2)。

表2 MADV检测体系重复稳定性实验数据Tab.2 Stability testing of real-time PCR for MADV detection

2.5 不明原因发热病例血清及蚊虫样本筛查 将2019-2020年宁夏回族自治区、浙江省和云南省的共计81份不明原因脑炎病例急性期血清标本(乙脑病毒IgM抗体检测为阴性)及161批库蚊标本提取RNA 后，利用建立的MADV TaqMan RT-PCR检测体系和反应条件检测，检测结果均为阴性。

3 讨 论

本研究建立的MADV TaqMan RT-PCR检测方法，选用基因序列中较为保守的区域作为扩增目标片段，最低检测限达到1.0×102拷贝/反应，变异系数(CV)均<1.5%，表明该检测体系具有良好的敏感性和稳定性，用MADV的RNA与多种虫媒病毒同时平行检测无交叉反应，证明该检测方法具有较高的特异性。用本研究所建立的方法筛查2019-2020年夏季在宁夏、浙江和云南3省的81份不明原因脑炎病例的急性期血清标本及161批库蚊标本，结果均为阴性，表明我国以上3个省近两年的蚊虫标本和不明原因急性脑炎急性期血清标本目前尚无MADV检出。

MADV作为在拉丁美洲流行的病原体，通过贝叶斯法构建系统进化树发现MADV最早可追溯到346年前，而且该病毒很可能起源于巴西[8]，主要能引起马脑炎，2019年在巴西东北部Ceará州报道了由MADV引起的马脑炎暴发[5]，马在感染MADV后会出现发热、极度虚弱、步伐不稳、肌肉抽搐等症状，甚至死亡[9]。此前，在美洲中部和南部从未发现人类感染MADV[10]，但2010年在巴拿马首次确诊了13位病人是MADV阳性，而且报道的病人主要是儿童，表明MADV具有致病性[6]。另外2016年，委内瑞拉在进行ZIKV筛查时发现一位12岁的小女孩症状与ZIKV感染十分吻合，但检测结果为ZIKV阴性，平行检测基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)和DENV等结果均为阴性，最后经病毒基因序列测定后鉴定为MADV感染[11]。人感染MADV后的主要症状表现与其它虫媒病毒感染类似，与登革热表征尤其相似[9]，患者会出现突然发热，体温可达(39～40 ℃)，还会出现头晕、恶心、乏力等症状，严重时会产生轻度偏瘫，后遗症严重，人群隐性感染率在2%～5%[12]。目前认为MADV的传播媒介主要是库蚊[13]，拉丁美洲的偏远地区的鼠和蝙蝠可能作为贮存宿主，但目前对于其传播的模式仍不清楚。综上所述，MADV能够引起人类疾病，而且临床症状与其它虫媒病毒难以区分，此外，根据委内瑞拉[10]、海地[2]和巴西[14]等地对人类急性发热病例中检测MADV的报道，MADV近年来在拉丁美洲流行不断，因此，建立快速、灵敏且特异的检测方法十分必要。

TaqMan RT-PCR技术是当今应用最为广泛的分子诊断方法之一，具有更高的敏感性、特异性和可重复性[15]，虽然我国尚未发现MADV感染的病例，但随着近年来国际交流日益密切，病原体的跨国传播风险日益升高。由于缺乏特异性试剂盒，MADV的血清学检测方法应用较少。目前发表的RT-PCR[10]、巢式RT-PCR[13,16]等分子生物学检测方法均需结合一代测序才能完成鉴定。相关方法总实验步骤多、检测用时较长，而本研究建立的MADV实时荧光定量PCR检测方法上机反应时间小于1.5 h，缩短检测用时，提升实验室检测时效性。本方法不仅可应用于实验室的早期检测，还将为今后开展MADV监测及研究工作提供良好的技术支持。

利益冲突：无

引用本文格式：殷启凯,刘文婧,王国玮，等. 马达里亚加病毒TaqMan RT-PCR检测方法的建立[J].中国人兽共患病学报，2022，38(5)：428-432. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.057