湖南省525株非结核分枝杆菌临床分离株的菌种鉴定与流行特征

李文彬，胡培磊，陈忠南，陈振华，易松林，余艳艳，郭靖玮，刘彬彬，王巧智，万康林，谭云洪

非结核分枝杆菌(non-tuberculosis mycobacteria，NTM)是指除结核分枝杆菌复合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTBC)与麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌，原称为非典型分枝杆菌(atypical mycobacteria)，其生物学特性有别于结核分枝杆菌[1-2]。非结核分枝杆菌广泛存在于自然界的土壤、尘埃、水、鱼类和家禽中，是一类条件致病菌。人类主要从环境中获得感染，引起非结核分枝杆菌病，即人类感染NTM可引起相关组织或脏器的病变，一般患病后主要表现为咯血、单侧无痛性淋巴结肿大、滑膜炎和骨髓炎等[3]。目前发现的NTM有249个菌种、17个亚种、5个变种，但是引起人类疾病的仅占少数，半个世纪前，由于结核病的肆虐，因此,人们对非结核分枝杆菌病未予以足够的重视[4]。

近年来，由于分子生物学技术的不断优化，使得实验室对NTM诊断技术不断提高，且人们对NTM 感染的重视以及艾滋病流行等因素，使得近年来NTM病呈快速增多趋势，甚至可能超过结核病的发病率和患病率，现已成为威胁人类健康的重要公共卫生问题[5]。由于不同种NTM感染后的临床症状和体征、感染治疗方案等方面可能存在不同，临床上多造成误诊、误治，使得患者病程迁延[6]，因此，鉴定NTM菌种对诊断和治疗有重要意义。近年来，NTM菌种鉴定技术取得了很大的进步，为临床提供了简单、实用以及快速的菌种鉴定技术[7]，促进了 NTM 感染性疾病诊断和治疗水平的提高。

本研究通过收集湖南省胸科医院2019年1月1日至2020年12月31日期间住院及门诊病人的痰标本或者其它体液标本，通过BACTEC MGIT 960系统(简称MGIT960)进行细菌分离培养，获得的阳性培养物，对初步鉴定为非结核分枝杆菌(NTM)的菌株进行菌种鉴定，并分析湖南省非结核分枝杆菌(NTM)的菌种类型及其分布特征，为非结核分枝杆菌病的防治提供基础科学数据。

1 材料与方法

1.1 伦理声明 本论文涉及的相关实验研究，经过本单位医学伦理委员会审核批准，入选的病例均来自我院就诊的患者，均获得知情同意。

1.2 实验材料

1.2.1 实验菌株 2019-2020年湖南省胸科医院经MGIT960培养阳性的6 515株分枝杆菌临床分离菌株。其中男性分枝杆菌感染者为4 456例，女性2 059例。

1.2.2 标准菌株 H37Rv标准菌株来源于中国疾病预防控制中心结核病控制中心国家结核病参比实验室。

1.2.3 试剂与仪器 抗酸染色试剂、改良罗氏培养基、对硝基苯甲酸(PNB)培养基购自珠海贝索生物技术有限公司；4% NaOH、pH6.8的磷酸盐缓冲液(PBS)由科室自配；BACTEC MGIT 960分枝杆菌分析系统及其配套试剂包括MGIT试管(含7H9液体培基)、油酸-白蛋白-右旋糖-过氧化氢酶(OADC)添加剂和杂菌抑制剂购自美国BD公司；MPB64抗原检测试剂盒购自杭州创新生物检控技术公司；PCR反应试剂购自北京全式金生物技术公司，引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成，PCR扩增仪购自杭州博日科技公司。

1.3 实验方法

1.3.1 分枝杆菌分离培养 临床标本首先接种于MIGT 960液体培养系统进行培养，对仪器报阳标本进行抗酸染色涂片，报告“分枝杆菌培养阳性”。

1.3.2 MTBC与NTM初步鉴定 首先使用MPB64蛋白免疫胶体金法初步鉴定，即直接吸取100 μL MGIT 960阳性菌株液体培养基的上清液加入到检测孔中，1 h内观察结果。检测线和质控线都出现红色条带即为阳性。随后取100 μL胶体金法判定为阴性的菌液分别接种于改良罗氏培养基(L-J)、PNB培养基，于37 ℃恒温培养箱进行培养[8-9]。观察菌落生长情况。鉴定结果判定标准见表1。

表1 MTBC与NTM初步鉴定判定标准Tab.1 MTBC and NTM preliminary identification criteria

1.3.3 NTM菌种鉴定

1.3.3.1 菌株DNA提取 鉴定为NTM菌株，经L-J固体斜面培养基培养后，于其上刮取1接种环菌落，置于生理盐水中制成菌悬液。使用lab-aid 824仪器提取 DNA，-20 ℃保存备用。

1.3.3.2 PCR 根据选取分枝杆菌16SrRNA和Hsp65基因片段序列，设计引物(引物信息见表2)，进行PCR扩增，16SrRNA和Hsp65的PCR扩增产物分别为800 bp和400 bp。

表2 NTM菌种鉴定PCR引物信息Tab.2 NTM strain identification PCR primer information

PCR总反应体系30 μL，引物各1 μL，2×Tag PCR Master Mix 15 μL，ddH2O 12 μL，模板1 μL，阴阳性对照孔加入结核分枝杆菌阳性质控品和结核分枝杆菌阴性质控品。扩增过程为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30个循环；72 ℃终延伸7 min。取10 μL扩增产物在2%琼脂糖(含GelRed 核酸染料)凝胶中电泳，观察目的条带是否正确。

1.3.3.3 测序及同源性比对 PCR扩增产物送北京睿博兴科生物技术有限公司进行测 序，利用BLAST将测序得到的基因序列与美国国立生物技术信息中心(NCBI网站)数据库作同源性比对，相似度≥97%即可确定菌种。

1.4 统计学分析 使用Excel软件对菌种鉴定结果进行统计分析。

2 结 果

2.1 分枝杆菌检出情况 2019-2020年，MGIT960培养系统报阳菌株数为6 527株，其中12株显示有杂菌生长，即共分离出6 515株分枝杆菌，其中MPB64抗原检测阳性4 921株，阴性1 070株；MPB64抗原阴性标本中，PNB阳性546株，阴性524株；PNB生长试验阳性的标本中，共有525株经16SrRNA和Hsp65测序鉴定确证为NTM。

2.2 NTM感染者人群、地区分布特征 本研究525株NTM感染者，男性285株，占比54.29%；女性240株，占比45.71%，NTM感染者男性多于女性；人群分布以农民为主，共367株，占比69.90%；城市居民158株，占比30.10%，职业分布以退休人员36人(6.86%)、无业人员27人(5.14%)和学生22人(4.19%)居多；年龄分布以40岁以上者最多，共402株，占比76.57%；20岁以下患者33株，占比6.29%；21～39岁患者90株，占比17.14%。NTM分离率较高的地区分别为郴州市(16.57%)、湘潭市(14.84%)、湘西自治州(12.89%)、岳阳市(11.79%)、衡阳市(11.66%)，其它市区的分离情况见表3。5 445株MTBC，其中男性3 807株，占比69.93%；女性1 638株，占比30.08%；MTBC感染者，同样以农民为主，共3 328株，占比61.12%。除农民外，职业分布以职员357人(6.56%)、学生351人(6.45%)、无业人员345人(6.34%)和退休人员292人(5.36%)居多。NTM和MTBC的职业分布见表4。

表3 2019-2020年湖南省不同地区NTM的分离率Tab.3 Separation rates of NTM in different regions of Hunan Province in 2019-2020

表4 NTM和MTBC患者职业分布情况Tab.4 Occupational distribution of patients with NTM and MTBC

2.3 NTM菌种鉴定结果 525株NTM均已测序鉴定确定菌种，525株NTM菌株，经16SrRNA和Hsp65基因测序分析，鉴定为27种，分别为脓肿分枝杆菌190株(36.19%)、胞内分枝杆菌174株(33.14%)、鸟分枝杆菌64株(12.19%)、戈登分枝杆菌47株(8.95%)、偶发分枝杆菌8株、马赛分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌各7株、龟分枝杆菌4株、猿分枝杆菌和瘰疬分枝杆菌各3株、慢生分枝杆菌2株、其它16种少见分枝杆菌各1株。主要流行的NTM菌种有7种，见图1。

图1 2019-2020年湖南省主要流行的NTM菌种占比情况Fig.1 Proportions of major NTM strains circulating in Hunan Province from 2019 to 2020

2.4 NTM菌种地区分布情况 本研究去除了非湖南省户籍的感染者检出的14株NTM，对本研究检出的湖南省不同地区、不同种的NTM的分离率统计结果如表5所示。脓肿分枝杆菌分离较多的地区为：郴州市(9.47%，16/169)、湘西自治州(8.89%，20/225)、衡阳市(8.07%，36/446)和永州市(5.38%，26/483)；胞内分枝杆菌分离较多的地区为：湘潭市(7.10%，11/155)、郴州市(7.10%，12/169)和岳阳市(6.46%，40/619)；鸟分枝杆菌分离较多的地区为：岳阳市(1.94%，12/619)和益阳市(1.57%，8/511)。

表5 常见NTM菌种地区分离情况Tab.5 Regional composition of common NTM strains

3 讨 论

近年来，全国流行病学调查显示NTM的检出率持续增高，本研究2019-2020年我院NTM的检出率为8.17%，仍处于较高水平。可能与人口老龄化、免疫缺陷、环境暴露以及基因芯片、分子生物学等检验技术水平提高等因素有关[11-12]。NTM 肺病多发生于原有慢性肺部疾病(如慢性支气管炎、支气管扩张症、支气管哮喘、COPD 和肺结核等) 的患者[13]。约1/3的艾滋病(HIV)患者可继发NTM 病，且在艾滋病和免疫功能受损者中通常表现为播散性NTM 病[14-15]。

由于现代细菌学的快速鉴别诊断方法不断发展，使得近年来，NTM的实验室检出率不断增加，随着分子生物学技术和免疫技术的不断发展，NTM的鉴定技术也得到了相当大的提高。目前，我国针对NTM的早期、快速诊断，尚无敏感且特意的标准化诊断程序[16]。PNB生长试验对MTBC和NTM 的鉴别能力较强，但是由于其是一种培养方法，所以试验耗时较长，且无法鉴定到具体的种水平。绝大多数MTBC在液体培养基中生长时分泌MPB64蛋白，因此，使用操作简单、快速的MPB64蛋白免疫胶体金法，可以初步鉴别MTBC和NTM，而少数不分泌此蛋白的MTBC的MPB64抗原检测呈阴性[17]。本研究，采用MPB64免疫胶体金法，可以快速鉴别出大部分MTBC，随后使用PNB生长试验可以鉴别出NTM 以及胶体金法阴性的MTBC，可以避免MPB64阴性的部分菌株被误认为是NTM。本研究，虽然MPB64胶体金法和PNB生长试验结合，节省了MTBC和NTM初步鉴定的时间，但是会使得MTBC和NTM混合感染的菌株数据丢失，仅有2株菌被鉴定为MTBC和NTM混合感染，而且PNB实验也会存在假阴性，作者将在后续实验当中重新对MPB64阳性和PNB阴性的菌株进行NTM鉴定，完善相关数据。

本研究通过收集湖南省胸科医院2019年1月1日至2020年12月31日期间住院及门诊病人的痰标本或者其它体液标本，经培养及鉴定后，其结果显示临床分离的NTM菌种主要为脓肿分枝杆菌(36.19%)和胞内分枝杆菌(33.14%)。NTM在年龄、性别、职业和地域分布上存在差异，NTM分离率较高的地区分别为郴州市(16.57%)、湘潭市(14.84%)、湘西自治州(12.89%)、岳阳市(11.79%)、衡阳市(11.66%)。不同地区菌种分布不同，即脓肿分枝杆菌分离较多的地区为：郴州市(9.47%)、湘西自治州(8.89%)、衡阳市(8.07%)和永州市(5.38%)；胞内分枝杆菌分离较多的地区为：湘潭市(7.10%)、郴州市(7.10%)和岳阳市(6.46%)；鸟分枝杆菌分离较多的地区为：岳阳市(1.94%)和益阳市(1.57%)。

本研究通过MTBC与NTM菌种鉴别，并通过流行病学统计分析出湖南省检出的NTM菌种主要以脓肿分枝杆菌和胞内分枝杆菌为主，为临床结核分枝杆菌病与非结核分枝杆菌病的明确诊断提供研究基础。由于近年来NTM发病率处于不断上升的趋势，对于NTM 病的防治仍需要更为有效的应对措施。因此，急需研发快速、经济、准确的NTM检测新技术，并依据菌种鉴定和药物敏感试验结果制定临床治疗方案，为广大患者缩短NTM病的确诊时间，可以早发现、早治疗，减轻患者痛苦、有效缩短病程。本院作为湖南省的结核病防治定点专科医院，具有来自全省14个地级市的大样本，且初步总结了近一年内NTM的检出率、易感人群以及近一年的NTM菌种分布特征，与文献报道的2012年1月至2017年NTM的检出率(8.04%)、人群和菌种分布特征相吻合[18]。因此,本研究可为了解湖南省NTM的感染现状提供一定的参考依据。

利益冲突：无

引用本文格式：李文彬，胡培磊，陈忠南，等. 湖南省525株非结核分枝杆菌临床分离株的菌种鉴定与流行特征[J].中国人兽共患病学报，2022，38(5)：417-422. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.050