植物青枯菌噬菌体保存方法的研究

刘露　林志坚　周挺等

中图分类号：S 476 文献标识码：A DOI：10.16688/j.zwbh 2020162

作物青枯病是一类典型的土传细菌性维管束病害，易发生，难防治。20世纪初，TWwort和dHerelle发现并报道了噬菌体（bacteriophage，phage），其广泛存在于自然界中。由于其具有寄生专一性、不易产生抗性等特点，被冠以细菌的天然“杀手”而备受关注，具有巨大的应用潜力。噬菌体是严格的专性活体寄生物，无完整细胞结构，具有株系间差异大等特点，导致在保存上必须采用不同的方法。Ackermann等报道，芽胞杆菌噬菌体AP50在-80℃下仅能存活6个月，而肠杆菌噬菌体PRD1保存12年效价仅降低3个数量级;王绍花2010年报道德氏乳杆菌噬菌体phiLdb在4℃下可保存6个月，于美玲2015年报道乳杆菌烈性噬菌体Lpla保存效果最好的温度是-80℃。高苗发现，青枯菌噬菌体∈RS-1原液于4℃下保存6个月后尚存较高的活性。因此，要开发利用噬菌体，首要的问题就是噬菌体的长期保存。由于不同的噬菌体形态结构各异，对不同条件的响应能力不同，以何种形式或方法保存，目前尚无明确定论。本研究以福建不同烟区分离的4株青枯菌噬菌体为对象，研究不同保存条件下噬菌体的活性变化，寻找适合噬菌体长期保存的方法。

1材料与方法

1.1供试菌株

青枯病菌Ral3tonia pseudosolanacearum Z5;青枯病菌短尾噬菌体Pl，P2，P3和P4均由本实验室分离、鉴定保存。

1.2青枯病菌培养

将保存于-75℃的青枯病菌Z5活化后挑取单菌落于装有100 mL NB培养基（蛋白胨5g/L、牛肉浸膏3 g/L、葡萄糖2.5 g/L，pH 7.2）的三角烧瓶中，28℃，180r/min振荡培养至浓度约1×10⁸cfu/mL，备用。

1.3噬菌体培养

按1%（ V/V）的接种量将噬菌体原液接种于1.2培养的青枯病菌悬浮液中，摇匀，静置15 min，28℃，130r/min振荡培养12～16h，获得噬菌体培养液，12000r/min离心5 min后经0.45μm滤膜抽真空过滤除菌，上清液为噬菌体原液，效价为2×10¹⁰PFU/mL，备用。

1.4噬菌体保存方法

设4个处理，处理1：噬菌体原液;处理2：噬菌体原液：青枯菌液=1：1（V/V，下同）;处理3：噬菌体原液：青枯菌液：40%甘油=1：1：2（1mL噬菌体原液和1mL青枯菌液以及2mL 40%甘油的混合液）;处理4：噬菌体原液：青枯菌液：80%甘油=1：1：2（1mL噬菌体原液和1mL青枯菌液以及2mL80%甘油的混合液）。分别置于-75、-25、4℃和室温保存，90、180、270 d和365 d分别取样，测定噬菌体的效价。

1.5噬菌体的效价测定

噬菌体效价（plaque-forming unit，PFU）：是指每毫升样品中所含有的具有侵染性的噬菌体粒子数，采用双层平板法测定，具体测定方法参照高苗的方法。

噬菌体效价（PFU/mL）=平均噬菌斑数×2×稀释倍数。

2结果与分析

4种不同处理的噬菌体分别在-75、-25、4℃、室温下保存的结果见表1～表4。结果表明，-75℃和-25℃下保存（表1、表2），4种处理的保存效果都较好，365d后效价下降0～3个数量级，其中噬菌体P4株系的保存效果最好，其次为噬菌体P1和P2株系，噬菌体P3株系较差，如保存365 d后噬菌体P4株系效价只下降0～1个数量级，噬菌体P3株系效价却下降1～3个数量级;4℃下保存（表3），噬菌体原液处理和噬菌体原液：青枯菌液=1：1处理的保存效果最好，365 d后效价下降1～5个数量级，其中噬菌体P4株系效价只下降1个数量级，噬菌体原液：青枯菌液：40%甘油=1：1：2处理的保存效果次之，365 d后效价下降5～7个数量级，噬菌体原液：青枯菌液：80%甘油=1：1：2处理的保存效果最差，90 d后效价下降6～7个数量级;室温保存的效果总体较差（表4），但其中噬菌体原液：青枯菌液=1：1处理的保存效果相对较好，180 d后效价下降1～2个数量级，270 d后效价下降6～7个数量级;其次为噬菌体原液处理，噬菌体Pl和P2株系保存90 d后全部失活，而噬菌体P3和P4株系保存180 d后，其效价下降6个数量级;噬菌体原液：青枯菌液：40%甘油或80%甘油=1：1：2处理的保存90 d后，噬菌体P1、P3和P4株系全部失活，但噬菌体P2株系采用噬菌体原液：青枯菌液：40%甘油=1：1：2处理，保存365 d仍有较高的活性，效价仅仅下降3个数量级。

3讨论

噬菌体的保存方法已有报道，主要集中在对动物病原细菌噬菌体的保存，常见的有噬菌体原液或噬菌体原液加入甘油、DMSO等保护剂，于室温、4℃、冻干、-75'C或液氮保存，但噬菌体不同，效果也不同。如李陇平等报道金黄色葡萄球菌烈性噬菌体加入7% DMSO，-80℃冷藏3个月，效价与初始效价保持同一个指数级;黎尔纳等报道3株木糖氧化无色杆菌噬菌体原液加入甘油或DMSO后，于-80℃、-20℃和4℃保存16个月后，其中2株的效价能稳定在初始状态，1株的效价降低1个数量级。本研究结果与前人的研究结果相似，供试的4株噬菌体同法同温保存，但效果不同，如采用噬菌体原液：青枯菌液：80%甘油=1：1：2方法-75℃保存365 d，噬菌体P3株系的效价下降2个数量级，而噬菌体P1、P2和P4株系的效价稳定在初始状态;采用噬菌体原液室温保存，90 d后噬菌体Pl和P2株系全部失活，270 d后噬菌体P3株系全部失活，而噬菌体P4株系仍有活性。

Golec等报道，-80℃下有尾噬菌体储存于宿主体内，不会影响噬菌体和宿主的生存能力;高苗报道噬菌体原液+20%甘油室温和4℃保存6个月后均检测不到噬菌斑。本研究结果显示，室温和4℃下添加宿主可提升保存效果，添加甘油反而不利;低温下（-75℃和-25℃）添加宿主对噬菌体的保存效果影响不大，但添加甘油可提升保存效果。室温下，噬菌体原液：青枯菌液=1：1保存180 d，效价下降1～2个数量级，而噬菌体原液保存的效价下降了6个数量级或全部失活;另外，添加甘油处理的噬菌体90 d后全部失活（噬菌体P2株系除外）;-75℃和-25℃下，添加甘油处理的保存365d，噬菌体效价降幅最大的仅2个数量级。由于噬菌体是一种寄生于活体细胞内的非细胞生物，一旦离开寄主就不能独立新陈代谢，但低温可降低其新陈代谢，保持活性，因此低温可提高噬菌体的保存效果;室温下，由于噬菌体的代谢活动正常，需要充足的宿主，因此添加宿主有利于噬菌体保持活性，若添加甘油，宿主受甘油保护，噬菌体的侵染几率下降或完全不能侵入，导致效价下降。

综上所述，噬菌体原液：青枯菌液=1：1处理在4种温度下保存都能保持较高的活性，尤其是室温保存180 d后，噬菌体效价仅下降1～2个数量级，保存270 d后噬菌体仍有较高的活性。该方法不需要添加保护剂，不受试验条件限制，可为今后噬菌体制剂的生产及应用提供参考依据，是青枯菌噬菌体最简单易行的保存方法。另外，无论何种处理，-75℃和-25℃的保存效果都表現最好，可长期保存噬菌体。