鼠李糖乳杆菌grx10 在常温褐色乳酸菌饮料中的应用

2022-06-07魏枫染刘媛贾志磊刘绒梅胡诗齐李启明

中国乳品工业 2022年5期

魏枫染，刘媛，贾志磊，刘绒梅，胡诗齐，李启明

（新希望乳业股份有限公司科技研究院乳品营养与功能四川省重点实验室，成都 610000）

0 引言

常温褐色乳酸菌饮料发酵剂目前多选用干酪（副干酪）乳杆菌，如副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei Lpc37。稳定性好[1]，但发酵时间久，且依赖进口，有技术风险，成本高昂[2]。若我国本土来源菌株能将其替换，既可节约成本也可证实我国相关企业具备自有菌株筛选和工业化应用能力。

鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus grx10，是我国自主分离筛选的益生型专利乳酸菌（专利号：ZL200810023014.X），源自新疆传统酸骆驼奶[3-5]。有研究表明，该菌株有较为显著地降低胆固醇及抑菌能力，并可应用于食品领域，发酵产酸能力较强[6]。

本研究旨在将grx10 应用于常温褐饮，完成实验室小试及生产线中试，综合评价菌种对褐变引起的质构及风味变化的适应能力和保质期内的稳定性[7-8]。

1 材料与方法

1.1 材料

脱脂乳粉（蛋白质≥3.2g/100mL，脂肪≤0.9g/100mL），NZMP 公司；食用葡萄糖，西王药业公司；白砂糖，双江南华糖业公司；果胶，安德利集团公司；柠檬酸，珍好食品配料公司；鼠李糖乳杆菌grx10，一然生物科技公司；副干酪乳杆菌Lpc37，杜邦公司。

RO 水，自制；分析纯氢氧化钠，环凯微生物科技公司。

1.2 设备

ICINAC 16 乳品酸化监控仪，AMS-Alliance 公司；LumiSizer611 稳定性分析仪，LUM 公司；RW 20 数显型顶置式搅拌器，IKA 公司；TA.XTplus 物性测试仪，超技仪器公司；MS603 电子天平，METTLER TOLEDO 公司；APV-1000 均质机，沃迪智能装备公司；BSC-250 恒温恒湿箱，博讯实业公司；SW-CJ-2FD 洁净工作台，安泰空气技术公司；T5+Rondolino 电位滴定仪，METTLER TOLEDO 公司；FE20 pH 计，METTLER TOLEDO 公司；DV-E 数显黏度计，BROOKFIELD 公司。

2 方法

2.1 配方工艺

（1）饮料基础配方。

褐色酸奶发酵液（脱脂乳粉10%、葡萄糖4%、发酵剂）25%、果胶0.4%、白砂糖8%、柠檬酸0.1%、RO 水约66.5%

（2）酸奶发酵工艺。

称取脱脂乳粉和葡萄糖→50～55 ℃搅拌化料→保温水合30 min→定容→20 MPa 均质—保温褐变3 h→冷却至接种温度→接种发酵→终点酸度停止发酵→破乳搅拌→冷却备用

（3）饮料调配工艺。

称取白砂糖、果胶等物料→70～75 ℃剪切化料→冷却至小于15 ℃→与酸奶混合→粗定容—检测并喷酸→定容→20 MPa均质→灭菌→冷却→灌装

2.2 grx10 发酵条件筛选

实验室研究grx10 在37 ℃及42 ℃（工业常用发酵温度）条件下不同接种量的发酵效果，接种量设定为A：1×107mL-1，B：2×107mL-1，C：3×107mL-1，D：4×107mL-1，E：5×107mL-1。通过发酵监测并结合生产实际探索grx10 在发酵褐色酸奶时（终点pH：3.60～3.70；终点酸度：150～180 °T），不同发酵温度下的最适接种量。

2.3 菌种质构对比

选取2.2 得到的最佳接种量，在37 ℃及42 ℃条件下发酵褐色酸奶，通过质构测定验证grx10 的适用性。

2.4 饮料感官品评

在2.3 的基础上进行常温褐色乳酸菌饮料小试，通过感官品评判断菌种最佳发酵温度，进一步评判grx10 的适用性。

2.5 货架期稳定性研究

在上述研究的基础上进行中试，保证只有菌种差异，其他配方及工艺完全相同。对样品进行稳定性分析，测定各项指标在离心加速条件下的具体变化，并进行货架期观测。稳定性评定细则如表1 所示。货架期观测会将饮料成品在常温（25～30 ℃）条件下贮存12 个月，观察沉淀、析水、颜色变化、脂肪上浮、风味变化情况等，并测定pH、酸度和固形物等指标，从而综合评判grx10 的稳定性。

表1 常温褐色乳酸菌饮料稳定性评定细则

2.6 项目评定及方法

2.6.1 发酵监测

利用发酵监测仪进行监测，以样品温度作为发酵监测起点，以pH 范围作为发酵监测终点，监测过程中每隔1 min 记录一次数据，数据处理时每1 h 计算pH平均值。

2.6.2 质构测定

利用物性测试仪测定硬度、稠度、内聚力、黏性等指标。参数设定如表2 所示。

表2 物性测试仪参数设定

2.6.3 感官品评

邀请15 名专业感官品评员进行描述分析型测试，以实际分数评判各项品评维度，以期准确显示在所评价的感官特性范围内不同处理组的各项特征，通过数据的处理分析得出相关结论。评定标准如表3 所示。

表3 常温褐色乳酸菌饮料感官评定标准

2.6.4 稳定性分析

利用Lumi 稳定性加速分析仪，量化产品在离心加速条件下各项稳定性指标的变化情况。参数设定如表4 所示。

表4 Lumi 参数设定

2.6.5 货架期稳定性观测

将产品置于样品架上，在常温（25～30 ℃）下放置12 个月，观察期内记录稳定性异常现象并量化其程度，观测指标如表5 所示。

表5 货架期观测指标

pH 值测定：利用pH 计在室温下测定并读数。

固形物测定：利用折光仪测定固形物指标。

酸度测定：利用酸度计测定酸度指标。

黏度测定：利用数显黏度计在室温下测定并读数（61#转子；20 r/min，30 s）。

密度测定：利用密度计测定密度指标。

显著性分析：利用IBM SPSS Statistics 24 应用软件进行分析。

3 结果与分析

3.1 grx10 发酵条件筛选结果

37 ℃下不同接种量发酵监测结果如图1 所示；42 ℃下不同接种量发酵监测结果如图2 所示。

图1 37 ℃条件下grx10 发酵监测

图2 42 ℃条件下grx10 发酵监测

由图1 可知，grx10 在37 ℃和42 ℃条件下，接种量1×107，2×107，3×107间差异显著（P＜0.05），3×107，4×107，5×107间差异不显著（P＞0.05）。37 ℃下不同接种量（从低到高）达到发酵终点（以pH 值3.65 计）的时间分别为：＞75＞75、61、58、57。42 ℃下分别为：＞52、45、35、34、33 h。

综上，37 ℃下，grx10 接种量为1×107，2×107时达到发酵终点所需的发酵时间均超过3 d，实际生产方面酸奶基料发酵过久占用发酵罐会造成较大损耗，使产品成本上涨，当接种量为3×107时61 h 即可达到发酵终点。而当接种量继续上涨时，其发酵速率并不会明显加快，接种量为4×107，5×107mL-1时较3×107mL-1达到发酵终点所需的时间相差＜5 h，能耗节约较少，但却要增加物料成本。综上，37 ℃下，grx10 的最适接种量为3×107。42 ℃下，发酵时间较37 ℃有明显缩短，grx10 接种量为1×107，2×107mL-1时达到发酵终点所需的发酵时间超过或接近2 d，接种量为3×107mL-1时35 h 可达发酵终点。当接种量继续增加时，其发酵速率亦不会明显加快，接种量为4×107，5×107mL-1时较3×107mL-1达到发酵终点所需的时间差别＜3 h。综上，42 ℃下，grx10 的最适接种量也为3×107mL-1。

3.2 grx10 与Lpc37 发酵褐色酸奶质构对比结果

37 ℃及42 ℃条件下鼠李糖乳杆菌grx10 与副干酪乳杆菌Lpc37 对比结果如图3 所示。图3 中字母a，b 表示差异显著性及多重比较结果。

由图3 可知，鼠李糖乳杆菌grx10 与副干酪乳杆菌Lpc37 在37 ℃和42 ℃下，达到发酵终点的酸奶质构，在硬度、稠度、内聚力、黏性方面差异均不显著（P＞0.05）。

图3 37 ℃及42 ℃下grx10 与Lpc37 发酵褐色酸奶质构对比

综上，不论发酵温度是37 ℃还是42 ℃，同一温度下，grx10 与Lpc37 作为发酵剂，制成的褐色酸奶在质构上差异均不显著（P＞0.05）。Lpc37 是常温褐色乳酸菌饮料中广泛应用的发酵剂，且市场售卖的产品保质期基本标示8～9 个月。所以作为对照组的grx10，二者在相同发酵温度及接种量条件下发酵的褐色酸奶，质构维度测定值相近可说明grx10 与Lpc37 作为发酵剂，对褐色酸奶质构的影响不相上下，且有研究证实鼠李糖乳杆菌对人肠道微生物菌群有益生作用[9]，所以grx10 可正常作为发酵剂使用，并达到Lpc37 发酵的质构状态。

3.3 饮料感官品评对比结果

饮料感官品评对比结果如表6 所示。

由表6 可以看出，发酵温度相同时，不同发酵剂制成的饮料，其各项感官维度评分间差异不显著（P＞0.05）；发酵温度不同时，相同发酵剂制成的饮料，其整体评价、风味释放、稠厚3 项感官维度评分差异显著（P＜0.05），色泽、酸甜2 项感官维度评分差异不显著（P＞0.05）。无论grx10 还是Lpc37 做发酵剂，37 ℃下的整体评价和风味释放平均分均高于42 ℃条件。

表6 饮料感官品评对比结果

综上，感官评价层面，37 ℃优于42 ℃，且由于鼠李糖乳杆菌可能出现热应激反应，故应尽量避免高温长时发酵[10]。所以，制备常温褐色乳酸菌饮料时，最佳发酵条件为37 ℃。该条件下，grx10 与Lpc37 制成的饮料感官评价差异小，进一步印证了grx10 可作为发酵剂用于常温褐色乳酸菌饮料，并达到Lpc37 作发酵剂的效果。

3.4 稳定性研究结果

在上述研究的基础上，保证只有菌种差异的前提下进行中试，将产品进行稳定性加速分析及货架期观测，结果如下。

（1）稳定性加速分析结果如图4 和图5 所示。由图4可以看出，37 ℃下，grx10 与Lpc37 制成的饮料在稳定性加速分析结束时，澄清指数的区间变化趋势及区间均值差异不显著（P＞0.05）。由图5 可以看出，37 ℃下，grx10 与Lpc37 制成的饮料在离心加速分析结束时，二者均出现底部沉淀现象，且沉淀量随时间均匀增加。其中鼠李糖褐饮沉淀层约为2 mm，副干酪褐饮沉淀层约为2.5 mm。

图4 褐饮中试样Lumi 澄清指数变化趋势对比

图5 褐饮中试样Lumi 分析

(2)货架期内稳定性观测结果如表7 所示。由表7 可以看出，12 个月货架观测期内，上部析水、颜色变化、絮凝及分层情况，grx10 与Lpc37 变化一致。底部沉淀情况，grx10 产品出现时间略早于Lpc37 产品，但二者沉淀量后期维持一致。10 月开始沉淀量超过2mm，颜色出现较严重变化，且出现絮凝及分层现象。所以产品维持稳定的期限为9 个月。

表7 货架期内稳定性观测结果

(3) 货架期内理化监测结果如表8 所示。由表8 可以看出，12 月观测期内，grx10 与Lpc37 在pH 值、固形物、酸度、黏度、密度方面的监测值接近，且变化趋势差异均不显著（P＞0.05）。pH 方面，第1～9 月略有浮动，总体维持在3.50～3.60 的正常范围，从第10 月开始，变化量增加；固形物方面，第1～9 月略有浮动，总变化量≤0.5，从第10 月开始，变化量较前9 月明显增加；酸度方面，第1～9 月略有浮动，月均变化量＜0.5，但从第10 月开始，变化量较前9 月明显增加，月均变化量＞2.0；黏度方面，第1～9 月略有浮动，总变化量≤3.0，属正常变化范围，但从第10 月开始黏度明显降低且变化量逐月递增；密度方面，第1～9 月维持不变，但从第10 月开始密度降低。

表8 货架期内理化监测结果

(4)货架期内感官评价结果根据上述观测结果，在9个月内每隔3 个月取样品评，结果如表9 所示。由表9可以看出，grx10 与Lpc37 在整体评价、色泽、风味释放、稠厚、酸甜等感官维度，同期对比差异均不显著（P＞0.05）。观测期内，二者整体评价及风味释放评分均在4.5分以上（含4.5 分），稠厚及酸甜也均在适中范围。

表9 货架期内饮料感官评价对比结果

综上，用grx10 和Lpc37 作发酵剂制成的中试样品，在稳定性加速分析结束时，其澄清指数的变化趋势及区间均值差异不显著（P＞0.05）；从变化曲线来看，grx10 与Lpc37 整体变化趋势相似，差异不显著（P＞0.05）。样品管上部透射率在分析结束时，grx10 约有0.5 mm 透射率降至59%～60%，Lpc37 约有0.5 mm 透射率降至55%～56%；中部透射率均从初始的10%～20%提升至80%～90%；底部透射率在分析结束时，grx10 约有2.0 mm 透射率降至0%～10%，Lpc37 约有2.5 mm 透射率降至0%～10%。说明产品货架期内可能会出现沉淀，且grx10 沉淀量较Lpc37 少，加速分析结果更优。货架期观测12 个月，第1～9 月grx10 与Lpc37 对比来看，在各项观测指标下的变化差异不显著（P＞0.05），维持稳定。但9个月以后，各项观测维度都开始有明显异变，无法维持稳定。但副干酪乳杆菌是应用性能良好的发酵剂，其在食品生产领域非常成熟[11-12]。所以，grx10 与Lpc37 两种发酵剂制成的饮料保质期均可达9 个月。保质期内，二者稳定性变化差异不显著（P＞0.05），感官评价差异不显著（P＞0.05）。说明grx10 的货架期稳定性与应用性能良好且广泛使用的Lpc37 相近。