人乳头瘤病毒基因亚型在尖锐湿疣患者及疑似患者中流行情况研究

陈 晨，朱琴芳，徐红星

（南京医科大学附属苏州市立医院医学检验科，江苏 苏州 215002）

人乳头瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）是一种嗜人体组织细胞的DNA病毒，可广泛感染人类皮肤、生殖道组织，引发增生性疾病，如尖锐湿疣（Condyloma acuminatum，CA），尖锐湿疣又称生殖器疣或病毒疣，近年来其发病率有上升趋势［1］。目前可分离200多种HPV基因亚型，与人类常见疾病相关的有30多种亚型，不同型别的HPV致病能力差异较大，依据HPV引起的增生性病变是否致癌，将其分为低危型和高危型，包括低危亚型6、11、42、43、44等，高 危 亚 型16、18、31、33、39、45、51、52、56、58型等［2］。为了解本地区尖锐湿疣感染年龄、性别、基因亚型等分布情况，笔者应用流式荧光杂交技术，就383例本院皮肤科就诊的尖锐湿疣患者及疑似患者进行HPV-DNA基因亚型检测，包括低危亚型HPV6、11、40、42、43、44、55、61、81、83十种型别，高危亚型HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、82十七种型别，现报告如下。

1 材料和方法

1.1 一般资料 尖锐湿疣患者及疑似患者383例来自本院皮肤科2018年8月1日至2020年1月30日的就诊患者，其中男性217例，女性166例，年龄（16～70）岁，平均年龄（33.1±10.7）岁。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 暴露疣体的疑似尖锐湿疣患者，行常规消毒，用无菌镊子摘取疣体组织，存放于专用保存液送检。其余患者，女性用无菌棉拭子擦去宫颈口的分泌物，用宫颈刷旋转4至5圈收集脱落细胞，或用无菌棉拭子于相应皮损部位反复摩擦后取出放入保存液送检；男性患者，也用无菌棉拭子于相应皮损部位反复摩擦，置保存液送检。

1.2.2 主要试剂和仪器

1.2.2.1 试剂 上海浩源生物科技有限公司生产的核酸提取试剂，上海透景生命科技股份有限公司生产的人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂（流式荧光杂交法）。

1.2.2.2 仪器 PerkinElmer Pre-NAT全自动核酸检测反应体系构建系统，ABI-Veriti基因扩增仪，多功能流式点阵仪Luminex200。

1.2.3 检测方法

1.2.3.1 核酸提取 采用Pre-NAT全自动核酸检测反应体系构建系统应用磁珠法进行样本核酸提取。高浓度胍盐将细胞或病毒蛋白外壳裂解，释放出核酸，游离的核酸吸附到磁珠颗粒表面，洗涤去除溶液中的杂质，最后将核酸从磁珠上洗脱下来，作为下游实验用模板。

1.2.3.2 流式荧光杂交方法 原理：采用通用引物多重PCR扩增，流式荧光杂交分型检测的方法，同时检测27种HPV DNA。试剂盒共设置了2类探针和28颗分类微球，其中，与HPV DNA杂交的探针包被在27个分类微球上，对应型别特异性探针的信号为阳性将被判定为该型别HPV阳性，质控微球是与人β球蛋白（β-globin）基因杂交的探针，它的结果提示取样、提取模板、PCR扩增和杂交整个过程是否符合要求。首先PCR扩增待检测样本DNA，得到的PCR产物与微球上交联的探针根据碱基互补配对原理杂交，微球上相应探针捕获到标有生物素（Biotin）的PCR产物，加入标记了链霉亲和素（SA）的藻红蛋白（PE）后，形成微球-探针-PCR产物-Biotin-SA-PE复合物，最后在多功能流式点阵仪上检测荧光信号。扩增与杂交参数：扩增体系为：10μl反应液，5μl引物，0.8μl聚合酶，5μl模板；扩增条件为：95℃ 5min、95℃ 30s、58℃ 30s、68℃ 30s扩 增5个 循 环，95℃ 30s、55℃ 30s、68℃30s扩增30个循环；杂交条件为：3μl扩增产物加22μl微球混匀，95℃ 5min、48℃ 30min，加75μlLSA-PE、48℃ 15min。

结果判断：如果PCR产物和探针完全配对，则在流式点阵仪上即可检测到分类微球的荧光信号，信号大于等于150，结果判断为阳性；如果PCR产物和探针不配对，则分类微球的荧光信号为背景信号，检测结果为阴性。

1.3 统计学处理 应用SPSS16.0软件进行统计，计数资料采用χ2检验，P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 尖锐湿疣患者及疑似患者年龄和性别构成 （21～30）岁年龄段就诊患者人数最多，占总人数的44.9%，其次为（31～40）岁年龄段，占30.8%，最少为＞60岁年龄段，占3.1%。就诊患者男性多于女性，分别占56.7%、43.3 %，男性和女性就诊人数均为（21～30）岁年龄段最多，分别占男女人数的45.2%、44.6%。＞60岁年龄段就诊患者以男性为主，占该年龄段男女人数83.3%，其次为（41～50）岁，占78.4%，≤20岁年龄段就诊患者以女性为主，占70%。具体结果见表1。

表1 383例就诊患者各年龄段性别构成

2.2 HPV总体感染及各年龄段男女患者感染率 383例就诊患者HPV阳性277例，阳性率为72.3%，其中男性感染158例，感染率为72.8%，女性119例，感染率71.7%，男女感染率差异不显著（χ2=0.059，P=0.807）。感染人群主要为（21～30）岁和（31～40）岁年龄段人群，感染率分别为68.6%和71.2%，（41～50）年龄段男性感染率明显高于女性，除该年龄段外其余年龄段感染性别差异不明显（χ2=6.286，P=0.179），男性最高感染率年龄段为＞60岁，该年龄段男性100%阳性，女性感染率最高年龄段为（51～60）岁和＞60岁，均为100%阳性。具体结果见表2。

表2 277例HPV感染患者不同性别各年龄段感染率

2.3 就诊患者感染类型 多重亚型高于单一亚型感染率，分别为37.6%和34.7%，不同年龄段单一感染与多重感染存在差异（χ2=16.679，P=0.005），二重以上亚型高达18.0%；低危亚型和高低危亚型混合感染为感染主要类型，两者感染率（29.5%和26.6%）高于高危亚型（16.2%），低危亚型及高危亚型均以单一亚型感染为主（23.5%与11.2%）。具体结果见表3和4 。

表3 277例HPV感染患者亚型数量与年龄段分布

2.4 检测结果亚型 低危亚型HPV6和11为主要型别。低危型感染阳性率排前五的是HPV6、11、81、43、55，依次为28.2%、17.0%、8.4%、5.5%、4.7%；高危型感染阳性率排前的是HPV16/52、58、51/68，依次为7.8%、7.0%、5.7%。HPV6多重略多于单一感染例数（58 vs 50），HPV11多重感染则明显多于单一感染例数（43 vs 22），其余各亚型也均为多重多于单一感染。从年龄结构分析各亚型，总体上分布在（21～30）岁，其次是（31-40）岁年龄段。具体结果见表5。

表5 277例HPV感染患者检测结果亚型

3 讨论

尖锐湿疣是临床常见的生殖器疾病，主要传播途径是性传播，常以亚临床感染形式存在，隐匿性、传染性强、复发率高，是由人乳头瘤病毒HPV引起的增生性疾病［3-4］。HPV是直径为50-55nm DNA病毒，具有高度的宿主专一性，由双链DNA构成，包括7900个核苷酸，所有HPV病毒的基因组结构相似，严格条件下进行杂交可确定病毒亚型。研究表明，HPV基因型的分布和流行存在明显的种族和地区差异，某种型别在特定区域占主导地位［5-7］。因此，了解本地区尖锐湿疣患者及疑似患者中HPV感染的年龄、型别等对流行病学调查具有重要意义。

表4 277例HPV感染患者高危与低危型感染情况

门诊就诊尖锐湿疣患者及疑似患者的年龄和性别分布情况分析表明，就诊患者在（21～30）岁年龄段为峰值（44.9%），随年龄增长而呈下降趋势（除外20岁及以下年龄段患者），与阮建波等结果一致［8］。就诊患者性别为男性多于女性，就各年龄段男女比例分析，基本为随年龄增加男性患者比例增加，60岁年龄段达83.3%；女性患者随年龄增加而减少，20岁及以下患者有70%为女性，应引起足够重视。有关就诊患者男女比例问题，未见有文献报道。

本次研究中，对总体感染率及各年龄段及男女各自的感染率进行了分析，结果表明，总体感染率男性与女性（72.8% vs 71.7%）经统计学分析无显著性差异。最高感染年龄段为（21～30）岁、（31～40）岁，合计感染率为72.9%，即以青年人为主要感染人群，与王稳等报道（21～30）岁检出数最多一致［9］。50岁以上的高年龄患者尽管就诊患者数少（36例），但共有35例阳性患者，该年龄段的感染率高达97.2%，即高年龄就诊患者一旦接触病毒，就有极高感染风险，可能与其免疫功能差有一定相关［10-11］。对该类人群，应做好宣传，避免直接或间接接触。

分析本组患者的单一和多重感染结果表明，277例感染者中，多重感染比例高于单一感染比例（52.0% vs 48.0%）。马贵涛［12］等报道，女性尖锐湿疣患者HPV单一感染60.51%多于多重感染39.49%，可能与单纯分析女性人群有关。同时，多重感染中二重感染比例与三重及以上感染比例基本各占一半，最多高达七重感染，分析其原因，可能尖锐湿疣患者因复发而导致不同亚型的感染。文献报道，尖锐湿疣患者存在细胞免疫功能异常，导致HPV发生免疫逃逸，从而引起反复感染［13-15］。从低危和高危亚型感染分析，本研究结果中，尖锐湿疣患者的感染以单纯低危和高低危混合感染为主，分别占HPV感染患者感染类型的40.8%和36.8%，剩余22.4%为单纯高危亚型感染，说明HPV低危亚型是尖锐湿疣患者的主要病原体［16］，但相当一部份人群单纯感染高危亚型，故针对尖锐湿疣患者，应进行HPV高低危分型检测，而不能仅检测HPV低危亚型。

文献报道，女性宫颈HPV亚型感染存在地域差异［17-20］。本文感染亚型结果分析显示，HPV6、HPV11是尖锐湿疣感染的主要型别，其次是HPV81、HPV16、HPV52。大连王稳等报道感染亚型前五依次为HPV11、HPV6、HPV16、HPV52、HPV53/58，广东马贵涛［12］等报道主要感染型别依次为HPV11、HPV6、HPV43、HPV16、HPV52/58，与本文结果有区别，故尖锐湿疣患者HPV感染存在地域差异，包括主要感染型别不同、阳性率不同及感染年龄段差异。