扫描电子显微镜在缓释微球制剂表征中的应用进展

陈 超，樊海丽，蔡志威，张传杰

(1.浙江省食品药品检验研究院，浙江 杭州 310052； 2.复纳科学仪器(上海)有限公司，上海 201100； 3.兰波(苏州)智能科技有限公司，江苏 苏州 215100)

微球是可降解高分子材料与药物均匀混合后制备的粒径范围在几微米到几百微米的球状聚合物，通过高分子材料的降解作用，同步释放药效[1-4].因微球制剂具有药效作用期长、给药次数少、不良反应低等特点，已成为缓控释制剂的主要剂型之一.

缓释微球的发展方向有释放稳定性及超长效释放.释放稳定性是通过有效的药物释放控制，避免血药浓度出现“峰谷现象”，以维持患者的血药浓度保持在一个稳定的状态.另外，已上市超长效释放微球可以实现一次注射即可获得几个月的稳定释放，相比于普通制剂，大幅减少了给药次数，进一步提高患者依从性[5-8].

扫描电子显微镜(SEM)是一种强大的成像工具，具有高分辨、高放大倍数、大景深的特点，成像性能远远优于光学显微镜.SEM利用聚焦后的高能电子束在样品上作光栅状扫描，电子束与样品相互作用产生二次电子、背散射电子、特征X射线等信号，通过不同的检测器对这些信号进行收集、放大、再成像，从而对样品表面微观形貌进行表征.

近年来，扫描电子显微镜与能谱分析技术越来受到大家重视，台式扫描电子显微镜能谱一体机的出现，增加了操作便利性，使得扫描电子显微镜在医药行业得到越来越广泛的使用[9-19].不局限于固体药物，通过冷冻样品台，甚至可以对半固态和液态样品进行表征[20-23].

1 SEM在微球制剂表征中的应用

微球的释放行为与其微观结构特征，如粒度分布、表面致密度、包封率、孔隙率等参数直接相关.微球结构受到生产过程中各类工艺参数的影响，如乳化参数、乳化剂浓度、温度、固化时间等[24-25].而在产业化线性放大生产时，微球结构的一致性控制难度较大.

微观结构是连接微球释放行为与工艺参数的桥梁.工艺控制的效果可以通过微球结构而获得，而微球的释放行为可以通过其微观结构而预测.同时放大生产时微球粒度一致性评价也可以通过尺寸测量而获得.

微球结构表征的常见方法为光学显微法，但光学显微镜分辨率较低，无法看清微米级的孔结构，而SEM可提供更为清晰的图像信息.

因此，本文从三个角度，对SEM在微球开发与放大生产的相关文献中的应用进行了总结，并通过SEM以及图像分析软件上机试验进行方法验证.试验中使用的仪器及软件：台式扫描电子显微镜Phenom XL (荷兰，Phenom-World B.V.),颗粒分析软件Phenom ParticleMetric(荷兰，Phenom-World B.V.).

1.1 微球粒度分析

微球粒度是药物释放动力学的主要决定因素[26-31].微球粒径大小及粒度分布对缓释微球的包封率、释放行为模式、降解速率都有很大影响，因此微球粒度分析是微球研发与生产工艺控制中的一个重要指标.同等条件下，微球粒度越小，则比表面相对较大，也就是说微球与体液接触比表面更大，药物释放则越快.而对于放大过程，微球批间粒度分布的一致性是生产质量控制的重中之重.

Klose等[31]以利多卡因作为模型药物，制备一系列的PLGA载药微球，并采用SEM对微球粒度进行表征，如图1所示.SEM图像结合释放行为研究表明，随着微球粒径的增大，微球的体外释放行为变慢.

图1 不同粒度微球的SEM图像[31]

Berkland等[29]通过SEM对微球粒度进行表征，不同粒度微球SEM图像如图2所示.结果表明，随着微球直径在10～100 μm范围内的增大，模型小分子药物的释放曲线逐渐变为较缓慢的S形曲线.同时作者提出，粒度分布均匀的微球，其总体释放行为与微球个体的药物释放的加权平均值是相对应的.但也可通过设计不同粒度的微球制备具有特殊粒度分布的混合物，以设计出所需的特定释放曲线，如超长效恒定释放等.因此，对微球混合物进行粒度分布设计，可以提供一种有效控制药物释放速率的方法.

图2 不同粒度微球的SEM图像(标尺尺寸 100 μm)[29]

在欧洲药典十部(2.9.52.Scanning electron microscopy)章节中提出：“可通过图像分析进行粒度分布统计”.而近年来，基于SEM的全自动颗粒粒形、粒径分析系统有了广泛的应用，可以对SEM图像中的颗粒进行自动识别，并可对粒径进行自动化统计，给出粒度柱状分布图、平均值、D10/D50/D90等统计结果.相比于光学显微镜，基于SEM的自动化分析软件具有更高分辨率，结果更准确，定量化的结果更具科学意义[32-33].

本文使用上述自动化颗粒识别与统计系统，对一组微球颗粒进行分析，结果如图3所示.软件分析了图像中包含的459颗颗粒，结果表明微球粒度分布范围为21～80 μm，呈正态分布，其粒径D50为55.8 μm.

图3 SEM图像分析结果：微球粒度分布分析

1.2 微球表面结构表征

微球表面结构对药物释放有着重要影响，微球表面微孔越多，孔径越大，释放也就越快.SEM可以通过观察微球表面微孔的变化，研究微球制备工艺，也可以通过图像间接预测药物的释放行为[34-39].

KIM等[39]采用乳化挥发法制备人生长激素微球，制得表面多孔微球.然后利用流化床设备制得无孔微球，SEM结果如图4所示.结果表明，不同方法制备的微球具有明显不同的表面孔隙形貌.而释放研究表明，无孔微球释药速度明显减慢，24 h累积释放量仅(6.2±1.1)%，可以获得1个月的长效释放.而多孔微球24 h累积释放量达到(85.6±1.0)%，前期突释明显.

图4 微球孔结构SEM表征[39]

为了降低前期突释，可以通过包覆的形式，获得具有核壳结构的双层微球.其内核为可生物降解聚合物材料与药物混合而成的多孔微球，然后通过另一种可降解的聚合物材料为外壳进行包覆[40-41].与多孔微球不同，双层微球的释放主要取决于核壳结构.因外壳的封闭效果较好，核壳微球的载药量和包封率都很高，但采取这种工艺时需要注意其工艺重现性与一致性.SEM可对核壳结构的包覆情况进行有效表征.图5为SEM表征的包覆前后的微观结构对比，图5(a)为多孔微球，包覆后的核壳微球如图5(b)所示，SEM结果表明，包覆工艺有效封堵了微球表面的微孔结构.

图5 多孔微球(a)及包覆后的核壳微球(b)

1.3 微球内部结构以及致密性评价

对于微球的中后期释放，其释放机理为溶液通过微球表面孔隙进入内部，沿着内部孔道逐渐溶解聚合物，随着微球骨架的溶蚀，药物逐渐释放.因此，微球内部结构特征直接影响药物的中后期释放，微球内部孔尺寸越小，越致密，则微球中后期释放速度越缓慢.反之，微球内部孔尺寸越大，越疏松，则微球中后期释放越快[42-43].通过制样，获得微球内部的断面，然后通过SEM进行表征，就可以得到微球内部的结构形貌，如图6所示.不同工艺条件下，获得的微球具有明显不同的内部结构.相对于图6(a)，图6(b)中的微球具有更小的内部孔径，结构更为致密.结果表明，SEM对这种工艺的研发以及产线质量控制具有重要意义.

图6 不同工艺条件下的微球断面表征

2 总结

由于高分辨率、高景深、高放大倍数的特点，SEM在微球制剂研发及放大生产过程中的质量控制方面有着广泛的应用潜力.通过文献综述以及上机试验的结果，充分验证了SEM对微球制剂表征中的重要作用.SEM可实现微球粒度分析.高分辨的成像使得微球表面以及内部的微孔结构清晰可见，还可用来评估核壳结构的包覆效果.在进行粒径分析时，可借助图像分析工具，将颗粒分析数量扩展到百颗甚至千颗量级，其结果更有科学统计意义.