2012—2018年长春市手足口病非肠道病毒A组71型肠道病毒V P1基因特征分析

张智丽，李晨光，张兴国，孙宇，崔薇，乔凤娟，孙炳欣

长春市疾病预防控制中心，吉林长春 130033

手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）是一种由多种肠道病毒引起的、我国法定报告管理的丙类传染病［1］，主要通过粪-口途径传播，也可通过呼吸道和接触传播，5岁以下婴幼儿为主要易感人群，好发于夏秋季［2］。自从我国将HFMD列入丙类传染病管理后，长春市HFMD病例报告始终位于丙类传染病前列［3］。2008—2012年，长春地区HFMD优势病原为肠道病毒71型（enteroviruses 71，EV-71）［4］，而近年来病原构成逐渐发生变化，EV-71占比逐渐下降，柯萨奇病毒A组16型（coxsackievirus A16，CV-A16）及其他肠道病毒比重逐渐增加［5-6］。HFMD至今仍无有效疫苗及特异性治疗手段。因此，加强疾病监测，准确处置疫情，开展健康教育是控制该病流行的关键［7］。本研究分析了2012—2018年长春市HFMD病例的病原学特征，为今后开展本地区传染病的预防控制工作提供科学依据。

1 材料与方法

1.1样本 收集2012—2018年长春市哨点医院和长春地区各县（市）区疾控中心采集的HFMD病例的肛拭子、粪便、咽拭子样本（获得长春市疾病预防控制中心伦理委员会批准）。严格按照卫生部印发的《手足口病预防控制指南（2009版）》［8］要求采集、运输、保存。纳入标准：①临床诊断病例。在流行季节发病，常见于学龄前儿童，婴幼儿多见，发热伴手、足、口、臀部皮疹，部分病例可无发热；极少数重症病例皮疹不典型，临床诊断困难，需结合病原学或血清学检查进行诊断。②确诊病例。临床诊断病例具有下列之一者即可确诊：肠道病毒（CV-A16、EV-71等）特异性核酸检测阳性；分离出肠道病毒，并鉴定为CV-A16、EV-71或其他可引起HFMD的肠道病毒；急性期及恢复期血清CV-A16、EV-71或其他可引起HFMD的肠道病毒中和抗体有4倍以上升高。

1.2主要试剂及仪器 全自动核酸提取仪、肠道病毒荧光定量PCR检测试剂盒购自江苏硕世生物科技股份有限公司；RT-PCR试剂盒（210212）、毛细管电泳仪（卡夹QIAxcel，DNA Screening Cartridge）购自德国凯杰（QIAGEN）公司。

1.3病毒核酸提取及PCR检测 采用全自动核酸提取仪提取样本核酸后，再利用肠道病毒荧光定量PCR检测试剂盒对样本中总肠道病毒、肠道病毒A组71型（EV-A71）和CV-A16进行荧光定量PCR。其中非EV-A71阳性样本VP1区利用引物［CV-A6-VP1-F：5′-TGTTGGGCACG（A）CACGTCTGGGA-3′，CV-A6-VP1-R：5′-CCAGCATAATTTGGGTTGGCT（C）TTG-3′；CV-A16-VP1-F：5′-CAGTAATACACACTAC（T）AGGGCA-3′，CV-A16-VP1-R：5′-ACCCTATAGTTGCCT（C）ACATATA-3′；CV-A10-VP1-F：5′-ATGGCDACAGGCAAGATGCT-3′，CV-A10-VP1-R：5′-ATAYCTAGCAGGGTAATACTC-3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成］进行RT-PCR扩增，扩增片段大小为1 000 bp。反应条件为：55℃30 min；94℃2 min；94℃15 s，55℃30 s，68℃40 s，共35个循环；72℃10 min。PCR产物用毛细管电泳仪（卡夹QIAxcel，DNA Screening Cartridge）进行检测，并送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.4生物信息学分析 用LaserGene软件包中Mega-Align软件对序列进行比对，截取VP1区进行后续分析。用于构建系统发生树的非EV-A71各基因型代表株的参比序列均来自美国国立生物技术信息中心GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）。采用NJ（neighbor-joiningmethod）法构建系统进化树，利用MEGA X软件，设置bootstrap值为1 000。

2 结果

2.1VP1区基因进化分析

2012—2018年长春市2 621例核酸检测阳性病例中，非EV-A71阳性样本VP1区PCR产物测序结果显示，共获得83条CV-A16序列、30条CV-A6序列和10条CV-A10序列。

2.1.1CV-A16分离株VP1区基因进化分析 基于VP1区（891 bp），对CV-A16序列及其各基因型和亚型参考株序列进行进化分析，结果显示，2012—2018年长春市HFMD病例中CV-A16毒株相对集中，83条序列均属于B1亚型，其中8条属于B1a亚型（2012年1条，2018年7条），其他均属于B1b亚型。见图1。

图1 2012—2018年长春市HFMD病例中CV-A16型VP1蛋白系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree of VP1 protein of CV-A16 in Changchun City from 2012 to 2018

2.1.2CV-A6分离株VP1区基因进化分析 基于VP1区（915 bp），对CV-A6序列及其各基因型和亚型参考株序列进行进化分析，结果显示，2012—2018年长春市HFMD病例中CV-A6毒株相对集中，30条序列均属于D3亚型。见图2。

图2 2012—2018年长春市HFMD病例中CV-A6型VP1蛋白系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of VP1 protein of CV-A6 in Changchun City from 2012 to 2018

2.1.3CV-A10分离株VP1区基因进化分析 基于VP1区（894 bp），对CV-A10序列及其各基因型和亚型参考株序列进行进化分析，结果显示，2012—2018年长春市HFMD病例中CV-A10毒株相对集中，10条序列均属于D2亚型。见图3。

图3 2012—2018年长春市HFMD病例中CV-A10型VP1蛋白系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of VP1 protein of CV-A10 in Changchun City from 2012 to 2018

2.2VP1区核苷酸序列同源性分析

2.2.1CV-A16流行株VP1区同源性分析 结果显示，CV-A16各流行株与CV-A16原型株的同源性为75.0%~77.0%，B1a亚型分支与B1a亚型参考株的同源性为92.3%~98.5%，B1b亚型分支与B1b亚型参考株的同源性为94.5%~99.2%，与B1c亚型同源性为88.4%~91.7%，与B2亚型同源性为89.3%~93.0%，其中与B1b亚型同源性较高，各株间同源性为88.2%~100.0%。见图4。

图4 2012—2018年长春市HFMD病例中CV-A16型基于VP1区序列的同源性分析Fig.4 Homology of CV-A16 based on sequence of VP1 region in HFMD cases in Changchun City from 2012 to 2018

2.2.2CV-A6流行株VP1区同源性分析 结果显示，CV-A6各流行株与CV-A6原型株的同源性为82.7%~83.5%，与B1亚型参考株的同源性为81.9%~93.7%，与B2亚型参考株的同源性为82.1%~84.5%，与C1亚型参考株的同源性为85.1%~86.5%，与C2亚型参考株的同源性为83.8%~84.8%，与D1亚型参考株的同源性为89.7%~91.1%，与D2亚型参考株的同源性为89.2%~91.3%，与D3亚型参考株的同源性为92.8%~98.1%，其中与D3亚型同源性较高，各株间同源性为91.6%~99.8%。见图5。

图5 2012—2018年长春市HFMD病例中CV-A6型基于VP1区序列的同源性分析Fig.5 Homology of CV-A6 based on sequence of VP1 region in HFMD cases in Changchun City from 2012 to 2018

2.2.3CV-A10流行株VP1区同源性分析 结果显示，CV-A10各流行株与CV-A10原型株的同源性为76.3%~77.0%，与B亚型参考株的同源性为78.9%~80.3%，与C亚型参考株的同源性为82.9%~83.8%，与D1亚型参考株的同源性为94.1%~95.4%，与D2亚型参考株得同源性为96.4%~98.4%，与D3亚型参考株的同源性为94.6%~96.1%，其中与D2亚型同源性较高，各株间同源性为96.4%~100.0%。见图6。

图6 2012—2018年长春市HFMD病例中CV-A10型基于VP1区序列的同源性分析Fig.6 Homology of CV-A10 based on sequence of VP1 region in HFMD cases in Changchun City from 2012 to 2018

2.3CV-A16流行株变异位点分析 CV-A6和CVA10流行株突变位点并未发现明显代表性，因此，选取CV-A16流行株进行变异位点分析。将所获序列中的代表序列经MEGA X软件翻译获得氨基酸序列后进行变异位点分析，以病毒流行株JX068833.1 BJ08/07 B1b为参考株，结果显示，CV-A16毒株中存在14个氨基酸位点变异，有12株在第14位点上发生N天冬酰胺→S丝氨酸（N14S）的变异，其中9株同时存在L215P变异，1株（ccHFMC2017030）同时存在N14S、L215P和F131S变异，另有1株（cc-HFMC-2017007）存在N14S、M23L和T94A 3个位点变异。有9株存在M23L变异，其中8株为B1a亚型，这8株除ccHFMC2012015外，均同时存在T164K和V251I变异，ccHFMC2012015则同时存在N218S变异。有2株同时存在T11A变异，其中ccHFMC2-016046同时存在I262V变异。在ccHFMC2017008、ccHFMC201430、ccHFMC201421这3株中则分别可见A22T、I235V和T289A变异。见表1。

表1 2012—2018年长春市HFMD病例中CV-A16型VP1区氨基酸变异位点Tab.1 Variation sites of amino acids in VP1 region of CV-A16 in HFMD cases in Changchun City from 2012 to 2018

3 讨论

HFMD是一种常见于婴幼儿和儿童的急性肠道传染病，病程复杂、症状多样，多数可自愈，少数病例会出现重症，甚至危及生命［9］。由于HFMD的病原具有多样性，且病原之间经常发生重组变异，因此，随着每年优势病原株发生变迁，就会引起新一轮HFMD的暴发流行［10］，在世界范围内造成了严重的疾病负担。

在国外，CV-A16常是大规模HFMD流行时的主要病原体［11］。以往研究多认为CV-A16仅引起轻症患者，但近年来，越来越多的报道显示，CV-A16感染也可引起心肌、脑部和肺部等疾病，甚至引起死亡［12-14］。我国自1981年首次报道CV-A16型HFMD病例以来，其他多个省份相继出现关于CV-A16型肠道病毒引起的HFMD暴发报道［15-16］。CV-A16被分为2个基因型：A和B基因型，而B基因亚型又分为B1和B2 2个亚型。对2012—2018年长春市83株CV-A16病原株VP1区的进化分析结果显示，近7年长春市CV-A16病原株均属于B1基因亚型，其中8条属于B1a亚型，其他均属于B1b亚型。从CV-A16 VP1区系统进化树上可以看出，B1b亚型上包括2012—2018年各年份的毒株，而B1a亚型的分支上仅有2012年的1条和2018年的7条流行株，表明2012—2018年长春市内B1a和B1b亚型属于共循环、共进化的过程，而B1b亚型的CV-A16一直是优势流行株，2018年B1a亚型与B1b亚型共同流行，这与其他省市的报道相同［17-19］。将B1a和B1b分流支分别进行同源性分析，发现B1b亚型分支与B1b亚型参考株同源性为94.5%~99.2%，B1a亚型分支与B1a亚型参考株同源性为92.3%~98.5%，各株间同源性为88.2%~100.0%，与广东、北京、河南等中国其他省份的CV-A16代表株来源相近，表明与其他病原体相比为区域性暴发。

变异位点分析发现，2012—2018年长春市HFMD病例CV-A16毒株中存在14个氨基酸位点变异，12株发现在第14位点上发生N天冬酰胺→S丝氨酸（N14S）的变异，这与2016年成都流行株（MW179030.1 ZG2016 B1b）相同，其中有9株同时存在L215P变异（2017年8株，2018年1株），提示该位点变异可能已演变为较稳定的基因特征被流行传递下来。有9株存在M23L变异，其中8株为B1a亚型，这8株除ccHFMC2012015外，均同时存在T164K和V251I变异，这与2018年广州流行株（MT119437.1 CHN/GZ/2018 B1a）相同。长春市有1株（ccHFMC2017-007）存在N14S、M23L和T94A 3个位点变异，VP1第94~108位氨基酸肽段是一个保守型线性中和抗体，可诱导产生抗CV-A16感染的中和抗体［20］，这可能降低亲和力和免疫优势，影响中和抗体结合。

自2008年，芬兰暴发了1起由CV-A6引起的HFMD疫情后［21］，全球各地均有CV-A6引起HFMD暴发流行的报道［22-23］，长春市2013年也曾暴发过由CV-A6引起的HFMD疫情［24］。目前国内将CVA6主要划分为A~D 4个基因型别，CV-A6原型株为A分支，未在国内流行。对2012—2018年长春市30株CV-A6病原株VP1区的进化分析结果显示，近7年长春市CV-A6病原株均属于D3基因亚型。2012—2018年长春市CV-A6流行株与CV-A6原型株的同源性为82.7%~83.5%，与B1亚型参考株的同源性为81.9%~93.7%，与B2亚型参考株的同源性为82.1%~84.5%，与C1亚型的同源性为85.1%~86.5%，与C2亚型的同源性为83.8%~84.8%，与D1亚型的同源性为89.7%~91.1%，与D2亚型的同源性为89.2%~91.3%，与D3亚型的同源性为92.8%~98.1%，其中与D3亚型的同源性较高，各株间同源性为91.6%~99.8%。目前长春主要流行的CV-A6毒株与国内其他地区流行的型别相同［25］，均为D3亚型，并未进化出新的型别。

虽然CV-A10并不是长春市HFMD的主要优势型别，但有研究表明，CV-A10与EV71相似，其感染导致重症和死亡的频率相对较高［26］。根据CV-A10的VP1基因序列，将CV-A10分为A~D 4个基因型，目前国内主要流行从B型和C型亚型逐渐转为D型亚型［26-27］。对2012—2018年长春市10株CVA10病原株VP1区的进化分析结果显示，与CV-A10原型株的同源性为76.3%~77.0%，与B亚型参考株的同源性为78.9%~80.3%，与C亚型参考株的同源性为82.9%~83.8%，与D1亚型参考株的同源性为94.1%~95.4%，与D2亚型参考株的同源性为96.4%~98.4%，与D3亚型参考株的同源性为94.6%~96.1%，其中与D2亚型同源性较高，各株间同源性为96.4%~100.0%。表明长春市2012—2018年CV-A10毒株为D2亚型，与国内其他地区主要流行的型别相同［28］，较为稳定。

目前，非EV-A71型肠道病毒引起的HFMD疫情日益加重，而对其研究相对较少，疫苗研发基础薄弱，研发难度大［29］。只有通过加强对HFMD病毒株的进一步研究，掌握病毒变异及进化状态，才能控制HFMD的流行。本研究通过对2012—2018年长春市非EV-A71毒株进行分析，探讨其传播规律和进化情况，对疾病防控具有重要意义。