不同生长期黄芩茎叶中野黄芩苷的含量变化＃*

王圣常 田素青 候爱霞 靳维荣

1.梁山县中医医院中药房,山东 济宁 272600;2.济宁市中医医院药剂科,山东 济宁 272000;3.泰安中医医院药剂科,山东 泰安 270000;4.山东省聊城市人民医院中药研究室,山东 济宁 252004

有关黄芩的记载,最早在《神农本草经》中可以看到,黄芩属于唇形科多年的草本植物,黄芩主要分布于我国的华北、东北和西南等地区。黄芩作为一种中药材,中医上在进行用药时,主要使用的时黄芩根,暴露在地上的黄芩茎和黄芩叶通常不作为中医用药的材料。但是,在进行实际采摘的过程中,很多非传统黄芩用药的部分,比如黄芩的叶、茎部与花朵等也和黄芩根一起采收了。且这部分中药材的产量远高于黄芩根的产量。但黄芩根之上的茎、叶与花都未得到充分利用,不仅造成了环境污染,还浪费了大量资源[1]。黄芩地上部分茎叶所含黄芩苷含量远低于根部,但野黄芩苷含量高达黄芩苷的10倍,几乎与根部持平[2]。

在中医范畴内,黄芩性寒,有苦味,有清热解毒、下火燥湿、止血安胎的功效。而且,现代研究表明,黄芩茎叶具有较强的抗氧化、抗炎、抗肿瘤、降压、降血脂、解热、镇痛、提高机体免疫力等药理学活性和高效低毒的特点,主要化学成分包括黄芩苷、野黄芩苷等黄酮类化合物[3]。过氧化物酶(POD)在植物体内比较常见,是一种活性比较高的酶。而且,在不同物种的不同生长时期,或是同一物种的同一时期的不同器官,以及同一器官不同组织内,都存在特异性。近几年,黄芩茎叶的研究已成为热点,通过我们前期对不同时期黄芩成分的研究,以及黄芩不同器官在不同采收期的过氧化物同工酶研究中发现不同生长期的黄芩POD同工酶种类发生变化。植物体内各种酶类变化会引起相应控制的化学成分变化,黄芩茎叶中以野黄芩苷为代表的黄酮类是否也发生相应的变化,目前还没有研究。本文采用反相高效液相色谱梯度洗脱法对不同生长期黄芩茎叶中野黄苷含量进行检测,以期为黄芩茎叶最佳采收期提供科学依据。

1 研究材料

1.1 仪器与试剂 高效液相色谱仪(Agilent 1100,美国安捷伦科技公司)；色谱纯:甲酸、甲醇(天津市科密欧化学试剂开发中心),其余试剂为分析纯；野黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所,批号27740ˉ01ˉ8)。

1.2 试验药材 黄芩茎叶:此次试验使用的样品已经由山东中医药大学石俊英教授鉴定,鉴定结果为本研究中黄芩茎叶均为干燥的黄芩茎叶。

1.3 观察指标 观察本次研究中黄芩苷、野黄芩苷线性范围及一年中不同采收期黄芩茎叶中野黄芩苷的含量。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 选用比较常用的C18高效液相色谱仪,色谱柱:Phenomenex Prodigy ODS3一C18(4.60 mm x 250 mm,5μm),流动相:甲醇ˉ0.02%(28:72)甲酸,流速为1.0ml/min,检测波长为276nm,柱温为30℃,进样体积为5μL。将流动相梯度洗脱时间程序进行调整,见表1。

表1 梯度洗脱时间表

2.2 对照品溶液制备 精密称取适量野黄芩苷对照品,用甲醇配制成浓度分别为0.096mg·mlˉ1的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 称取黄芩茎叶各0.3g,精密称取后,加入浓度70%的40ml乙醇,加热回流3.0 h,放冷,滤过,滤液置100ml容量瓶中,取少量的70%乙醇对容器和残渣进行分次洗涤,洗液滤入同一量瓶中,加70%乙醇至刻度,摇匀,即得。

2.4 线性范围的考察 精密量取上述野黄芩苷对照品溶液,照品溶液,分别进样5.0,7.5,10.0,12.5,15.0,20.0μl,按上述色谱条件测定峰面积值。以进样量为横坐标(X),峰面积值为纵坐标(Y),得回归方程:Y＝196.4X＋216.55,r＝0.9994,结果表明野黄芩苷进样量在0.470 0～1.8800μg范围内呈良好的线性关系。结果图2和表2。

表2 野黄芩苷、黄芩苷线性范围Table 4-8 Linear ranges of scutellarin and baicalin

图2 野黄芩苷、黄芩苷标准曲线Fig.2 Linear ranges of scutellarin and baicalin

2.5 精密度考察 精密吸取对照品15μl,连续进样6次,测定野黄芩苷峰面积,其RSD为0.3%,说明仪器精密度和方法精密度良好。

2.6 稳定性考察 精密吸取同一供试品溶液5μl,分别测定0,1,2,3,5,9,12,24,48,72 h野黄芩苷在72h内峰面积的RSD值分别为0.86%,说明样品在72 h内稳定,表明样品溶液在72 h内是稳定的。

3 样品重复性良好。

3.1 样品含量测定取黄答茎叶各0.3g,精密称定,按“2.1”项下的实验方法对黄答茎和叶进行含量测定,每批平行测定3份,计算其含量,样品图谱见图5～7。结果见表5～7。

图5 .混合对照品HPLC图

Fig.5 HPLC of reference substance

图6 .黄芩茎叶HPLC图谱

Fig.6 HPLC of Radix Scutellaria

表3 黄芩茎叶中黄酮类成分的含量(n＝3)

图4 11黄芩茎叶中黄酮类成分的含量

2.6 不同生长期黄芩茎叶中野黄芩苷含量变化 采收1年中不同生长期的黄芩茎叶约1g,精密称定后,按“2.1”项下的实验方法对野黄芩苷的含量进行测定,测定总黄酮中的野黄芩苷含量,见表4。

表4 年中不同生长期黄芩茎叶中野黄芩苷含量(n＝3)

4 讨 论

黄芩在中药材中属于大宗药材,而我国每年都会生产大量的黄芩茎叶,但对于黄芩药材的管控并无严格规定。近几年来,随着有关黄芩茎叶的研究不断深入,如何充分利用黄芩茎叶资源也成为了人们关注的焦点。由于目前国家和地方尚无明确的黄芩茎叶药材使用标准,也无有关黄芩茎叶研制、生产和经营等方面的明确规定,导致黄芩茎叶药材的管理也受到了限制。因此,加强对黄芩茎、叶等不同部位的野黄芩苷含量进行测定,既有助于明确黄芩茎叶的化学成分生物合成机理,也有利于确定黄芩茎叶药材最佳的采收期。同时,还能够为黄芩茎叶药材质量标准的制定提供相应的理论依据。

在前期的试验中发现,使用高效液相色谱法对黄芩茎、叶和花进行检测是,黄芩茎、黄芩叶和黄芩花中的野黄芩苷色谱峰信号比较强,因此,试验可以选择野黄芩苷作为检测的指标。并对采用不同提取方法对野黄芩含量检测结果的影响进行分析,结果显示采用70%乙醇作为提取溶剂的时候,先将其静置半小时,再使用超声进行处理半小时,最后测定的黄芩茎、叶和花中野黄芩苷含量最多。因为考虑到超声提取的测定方法比较简单易操作,因此,在进行研究时,可以选择70%乙醇超声检测的方式进行提取。通过扫描紫外光谱的结果显示,335nm波长下吸收最大,因此在试验时可以选择335nm波长作为检测的波长。

在本次研究中,采用HPLC法来测定黄芩茎叶中野黄芩苷的含量,并分别对一年中不同生长期内黄芩茎叶中的野黄芩苷进行测定,研究结果显示不同生长时期黄芩茎、叶中的野黄芩苷含量也存在变化,而7、8月份黄芩茎叶中的野黄芩苷含量比其他月份的野黄芩苷含量更高。研究结果说明,黄芩茎叶最佳的采收期是秋季7、8月份的时候。从化学成分上看,野黄芩苷是黄酮类化合物,通常存在于糖结合或是游离状态的中药材中。在植物的叶子、花朵与果实等组织中,野黄芩苷主要以苷的形式存在,在植物茎部则以游离苷元的状态存在[5]。在植物体内的生物合成途径中,黄酮类化合物多为复合型,是乙酸ˉ丙二酸和莽草酸途径生物合成的产物。而查尔酮异构酶和查尔酮合成酶经形成二氢黄酮,再由植物体内其他酶作用后,形成野黄芩苷。由于上述两种原因,黄芩叶中野黄芩苷的含量比黄芩茎中的含量高。

黄芩作为多年草本植物,黄芩茎叶最佳的开花期是7ˉ8月份的时候,8ˉ9月份是果实成熟期。这个时间在北方正值夏秋交替之际,夏天植物由营养生长期转为生殖生长期,受到气候的影响,黄芩茎叶也逐渐开始枯萎、凋落。除此之外,黄芩叶比较脆,采收、晾晒和运输期间容易出现脱落的情况,郭梅[6]等人的研究结果显示,同一生长期内黄芩茎、叶中的野黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩苷和木犀草素等黄酮类化合物含量差异较大。其中,黄芩茎、叶中的野黄芩苷含量高于其他3种黄酮类化合物含量,该研究结果与本次研究的结果有相符之处。另外,郭梅等人的研究结果显示黄芩叶中野黄芩苷的含量在5月最高,主要原因在于5ˉ6月份是黄芩茎叶生长期,处于地上部分的黄芩叶生长旺盛,黄芩根部合成的黄酮类化合物转移至地上部分,因而使得黄芩叶中的野黄芩含量增加。另外,从本次研究测定的结果看,黄芩叶中的黄芩苷含量明显比黄芩茎中的黄芩苷含量高,因此,在黄芩茎叶的药材质量检测中还需要添加有关黄芩茎叶的检查项目,并对称取的重量设定标准,以便为黄芩茎叶药材的质量判断,提供相应的参考依据。

综上所述,高效液相色谱法可以测定不同生长期黄芩茎叶中也黄芩苷的含量水平,确定黄芩茎叶最佳采收期,能够为黄芩茎叶药材质量标准的制定提供参考依据。