炒制温度及时间对黄芩主要成分含量的分析

汤泮泮 叶兴蓉 夏伟军 段媛昌 丁 茜 冯莉萍 梅双喜 杨增明 崔 涛 王京昆 董 汛 云南省药物研究所 云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室，云南 昆明 651000

黄芩始载于《神农本草经》，具有清热燥湿、解毒止血、安胎等功效，临床用有黄芩和炮制品，一般炒缓其寒性，现代研究表明黄芩中的主要活性成分为黄酮类化合物，其主要有抗菌[1-2]、抗炎[3]、抗氧化[4]、抗肿瘤[5-6]等药理作用。其中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素4种成分含量较高，其量的高低是评价黄芩及其制剂的主要质量控制指标[7-9]。研究采用HPLC建立了同时测定黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素4种主要有效成分的方法，在此方法下，探讨不同加热温度及时间对4个指标性成分的变化情况，阐述其变化规律，以期为炒黄芩的炒制加工研究及质量控制提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 DIONEX Ultimate 3000高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技)；DHG-9145A电热鼓风干燥箱(上海一恒)；ME204/02型电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；SK-8200HP型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)。

1.2 试药 黄芩苷(批号：110715-201821，含量以95.4%计)、汉黄芩苷(批号：112002-201702，含量以98.5%计)、黄芩素(批号：111595-201808，含量以97.9%计)、汉黄芩素(批号：111514-201706，标定后含量以94.4%计)等均购于中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯，纯净水由Milli-Q纯水系统制备。

1.3 材料 黄芩药材(购于河北省宽城县)，经云南省药物研究所付德欢主任药师鉴定为唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，批号：190201。除去杂质，洗净，蒸30 min，取出，切薄片，即可。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 以InterSustain C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)为色谱柱，流动相乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脱程序：0～10 min，22%～25%A；10～15 min，25%A；15～25 min，25%～32%A；25～30 min，32%～40%A；30～35 min，40%A；35～40 min，40%～50%A。流速1.0 mL/min;检测波长：276 nm;柱温：30 ℃，进样量为10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对照品适量，用体积分数为70%甲醇配制成浓度分别为0.3049、0.08258、0.05142、0.0203 mg/mL的混合对照品溶液A，备用。

分别精密称取黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对照品适量，用体积分数为70%甲醇配制成浓度分别为0.6296、0.4129、0.1119、0.01665 mg/mL的混合对照品溶液B，备用。

分别精密称取黄芩苷，汉黄芩苷，黄芩素，汉黄芩素对照品适量，用体积分数为70%甲醇配制成浓度分别为0.3635、0.07176、0.01207、0.0393 mg/mL的混合对照品溶液C，备用。

2.2.2 供试品溶液的制备 取炒黄芩粉末(过四号筛)0.1g，精密称取，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，超声处理(400 W，53 kHz)15 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减少的重量，摇匀，取续滤液，即可。

2.2.3 空白溶液 以体积分数为70%的甲醇作为空白溶液，进样，即得。

2.3 系统适用性 实验取2.2项下制备的供试品溶液、混合对照品溶液A以及空白溶液各10 μL，按照2.1项下色谱条件进样检测，色谱图如图1所示。由图1可知，4种成分色谱峰分离度良好，空白溶液无干扰。

1.黄芩苷；2.汉黄芩苷；3.黄芩素；4.汉黄芩素 A.对照品；B.药材；C.炒黄芩；D.空白图1 HPLC色谱图

2.4 线性关系考察 分别精密量取2.2.1的混合对照品溶液B各5、2、1、0.4、0.2、0.1 mL置于10 mL量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，取续滤液。按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，以各成分进样质量浓度(μg/mL)为横坐标(x)，其对应色谱峰的以峰面积为纵坐标(y)，进行线性回归计算。结果见表1。

表1 4种成分线性关系

2.5 精密度实验 取炒黄芩粉末(同一批号190201)，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6次，计算黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素峰面积的RSD值分别为0.31%、0.46%、0.32%、0.24%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性实验 取炒黄芩粉末(同一批号190201)，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、24 h按2.1项下色谱条件测定，计算黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素峰面积的RSD值分别为0.27%、0.32%、0.44%、0.49%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性实验 取炒黄芩粉末6份(同一批号190201)，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，计算黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量分别为15.38%、2.84%、0.47%、0.14%，RSD值分别为0.22%、0.43%、1.20%、1.41%(n=6)，表明重复性较好。

2.8 回收率 实验称取已知指标成分含量的炒黄芩粉末约0.05 g(同一批号190201)，9份，精密称定，分别置于具塞锥形瓶中，分别量取2.2.1项下制备的对照品溶液C 10 mL、20 mL、30 mL，置于锥形瓶中，平行做3份，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定4个成分的含量，计算4种成分回收率。结果见表2。

表2 回收率实验结果

表2 回收率实验结果

3 黄芩炒制过程中指标性成分的变化规律

为了避免结果因炒制过程中受热不均而受到影响，故通过电热鼓风干燥箱加热的方式来模拟炒制时加热过程，探讨不同加热时间及温度时4个指标性成分的变化情况。

3.1 受热温度对指标性成分的影响 分别精密量取黄芩混标溶液A各2 mL，置于5 mL圆底烧瓶中，减压浓缩至干，再分别取黄芩粉末5 g(同一批号190201)，平铺于培养皿中，分别在80、100、120、140、160、180 ℃的烘箱中加热30 min，取出，放冷，对照品精密量取70%甲醇2 mL使溶解，样品按2.2.2项下方法制备供试品溶液，上述样品按2.1项下色谱条件测定，计算黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量。结果如图2、图3所示。

图2 不同温度对4个指标性成分含量变化趋势图

1.黄芩苷；2.汉黄芩苷；3.黄芩素；4.汉黄芩素A.80 ℃；B.100 ℃；C.120 ℃；D.140 ℃；E.160 ℃；F.180 ℃图3 不同温度对4个指标性成分影响HPLC色谱图

由图2、图3可知，加热时间为30 min时，随着加热温度升高，黄芩中黄芩苷含量有略微升高，在140 ℃后明显降低，至180 ℃后，黄芩苷含量由14.35%降低至12.34%；汉黄芩苷含量变化趋势同黄芩苷，在140 ℃后明显降低，至180 ℃时，汉黄芩苷含量由2.68%降低至2.01%；黄芩素含量变化呈上升趋势，黄芩素含量由0.39%增加至1.61%；汉黄芩素含量变化趋势同黄芩素，汉黄芩素含量由0.12%增加至0.60%；对照品在加热至160 ℃～180 ℃时，出现了焦点，炭化现象，黄芩苷和汉黄芩苷未检出，黄芩素和汉黄芩素含量也随之减少，这与文献报道相一致[10]。

3.2 受热时间对指标性成分的影响 分别精密量取黄芩混标溶液A各2 mL，置于5 mL圆底烧瓶中，减压浓缩至干，再分别取黄芩粉末5 g(同一批号190201)，平铺于培养皿中，分别在120 ℃和150 ℃的烘箱中加热15、30、60、90、120 min，取出，放冷，对照品精密量取70%甲醇2 mL使溶解，样品按2.2.2项下方法制备供试品溶液，上述样品按2.1项下色谱条件测定，计算黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量。结果如图4和图6、图5和图7所示。

由图4可知，加热温度为120 ℃，随着加热时间，对照品中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素无明显变化，但是黄芩样品中黄芩苷含量由14.46%降至14.43%，汉黄芩苷由2.56%升至2.64%，含量变化趋势甚微，黄芩素含量由0.39%增至0.65%，汉黄芩素含量由0.12%增加至0.23%。

由图 5可知，加热温度为150 ℃，对照品中黄芩苷和汉黄芩苷随着时间延长，逐渐到未检出其含量，而黄芩素含量由0.11 mg升至0.35 mg，汉黄芩素含量由0.04 mg升至0.13 mg，但是在90 min后两者含量有所下降；黄芩样品中黄芩苷含量由13.12%降低至10.80%，汉黄芩苷含量由2.29%降至1.59%；但是黄芩素含量由0.39%增至2.21%，汉黄芩素含量由0.12%增加至0.82%。

图4 120 ℃不同受热时间对4个指标性成分含量变化趋势图

图5 150 ℃不同加热时间对4个指标性成分含量变化趋势图

1.黄芩苷；2.汉黄芩苷；3.黄芩素；4.汉黄芩素 A.0 min；B.15 min；C.30 min；D.60 min；E.90 min；F.120 min图6 不同加热时间4个指标性成分HPLC色谱图(120 ℃)

1.黄芩苷；2.汉黄芩苷；3.黄芩素；4.汉黄芩素 A.0 min；B.15 min；C.30 min；D.60 min；E.90 min；F.120 min图7 不同加热时间4个指标性成分HPLC色谱图(150 ℃)

4 讨论

4.1 不同受热温度对黄芩中4个成分含量的影响 当加热温度为120 ℃时，单体成分和黄芩成分中的黄酮类成分含量变化不明显，说明不发生苷键断裂反应。当120～150 ℃时，黄芩苷、汉黄芩苷黄酮类成分之间的苷键断裂反应开始，并且随着温度的升高，逐渐增强，转化为黄芩素和汉黄芩素。当温度180 ℃时，可能黄芩中4个成分自身不稳定性，因此成分含量都有所下降。

4.2 不同受热时间对黄芩中4个成分含量的影响 在温度为120 ℃时，随着时间延长至120 min，单体成分和黄芩成分中4个成分含量变化不明显，说明在此温度下，4个成分化学结构较为稳定；但是在温度为150 ℃时，随着时间延长至30 min，单体成分和黄芩成分中4个成分含量变化不明显，但是30 min以后，黄芩苷、汉黄芩苷黄酮类成分之间的苷键断裂反应开始，黄芩中黄芩苷和汉黄芩苷成分含量总体呈下降趋势，黄芩素和汉黄芩素成分含量总体呈上升趋势。

从黄芩苷和汉黄芩苷结构分析(如图8所示)，两者都由黄芩苷类和葡萄糖醛酸组成，在受热过程中，葡萄糖醛酸从黄芩苷和汉黄芩苷上脱落，逐渐形成黄芩素和汉黄芩素。据文献[11]研究及推测黄芩苷和汉黄芩苷在受热时降解反应不仅发生在糖苷键上，还有可能先发生异构化的降解途径，再发生糖苷键水解脱去糖醛酸生成黄芩素，其后黄芩素又发生聚合反应生成黄芩素二聚体。

图8 4个成分之间的化学反应示意图

综上所述，单体成分加热过程中，4个指标成分含量变化是显而易见的，主要受苷键裂解和自身破坏因素的影响。黄芩在炒制过程中，化学成分的变化是复杂的，除了苷键裂解外，还有可能存在其他复杂反应，炒制时间、炒制温度、药材自身稳定性等因素都有可能导致各化学成分最终含量的高低。既要保证对黄芩的杀酶保苷效果，又要确保其功效，因此应根据临床应用选择适合的炒制方法。