球孢白僵菌产孢条件优化研究

王加男，赵虹薪，刘洋，姜鸿涛，秦秀丽

（吉林农业科技学院生物与制药工程学院，吉林 132101）

在农业生产中，虫害是导致果蔬及农作物减产的主要原因之一。目前，防治虫害主要以喷洒化学农药为主，不仅造成环境污染，还使害虫产生抗药性，杀虫效果降低。喷施化学农药导致果蔬及农作物农药残留，用这些原料加工食品，对人体健康造成危害。因此，使用生物农药已成为绿色农业防治虫害的重要措施。真菌性杀虫剂是生物农药的重要组成部分，球孢白僵菌是研究应用最多的昆虫真菌性杀虫剂，具有致病性强、应用范围广、对环境无明显污染等优点[1-3]。球孢白僵菌对环境安全，在绿色农业生产中具有广泛的应用前景[4-5]。球孢白僵菌产孢数量与杀虫效果呈正相关[6]。目前关于球孢白僵菌菌剂的产孢条件报道较少。本研究对球孢白僵菌菌剂产孢条件进行探讨，筛选球孢白僵菌菌剂产孢适宜的培养基配方和培养条件，旨在为球孢白僵菌菌剂的生产提供依据。

1 材料方

1.1 试验材料

1.1.1 趋避试验供试菌株球孢白僵菌JN06由吉林农业科技学院农学院植物保护实验室提供。

1.1.2 菌种活化培养基萨氏培养基：蛋白胨10 g/L，葡萄糖40 g/L，琼脂20 g/L，pH 5.5～6.5，将其配制成斜面试管培养基备用。

1.2 孢子液制备

将球孢白僵菌JN06接种于萨氏斜面试管培养基，于25℃恒温培养箱中培养至分生孢子成熟。然后用无菌水将孢子冲洗至300 mL三角瓶中，用磁力搅拌器均匀打散，将孢子悬浮液孢子浓度调至107个/mL，4 ℃冰箱保存备用[6-7]。

1.3 产孢培养基配方优化试验

1.3.1 碳源优化试验(1)主要原料优化。分别为A：玉米糠97%；B：玉米糠87%+麦麸10%；C：玉米糠87%+玉米粉10%；D：玉米糠87%+10%大麦米；E：玉米糠87%+10%高梁米为主要原料，大麦米及高梁米用水浸泡24 h后捞出，将主料拌匀，分别加入1%蔗糖、蛋白胨、CaSO4配制培养基，培养基含水量调至60%。(2)速效有机碳源优化。在筛选出的主要原料中，分别加入1%葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、乳糖、蛋白胨、CaSO4配制培养基，培养基含水量调至60%。

1.3.2 氮源优化试验在筛选出的主要原料中，分别加入1%蛋白胨、酵母粉、鱼粉、尿素、NH4NO3以及优化的1%速效有机碳源、1%CaSO4配制培养基，培养基含水量调至60%。

1.3.3 无机盐优化试验在筛选出的主要原料中，加入优化的速效有机碳源和氮源各1%，再分别添加1%的CaSO4、KH2P O4、MgSO4，以及CaSO40 .5%+KH2P O40 .5%、CaSO40 .5%+MgSO40 .5%、KH2P O40 .5%+MgSO40.5%配制培养基，培养基含水量调至60%。

1.3.4 培养基适宜配方优化试验根据上述单因素试验结果，设计4水平5因素L16（45）正交试验，如表1所示，配制16种培养基，确定最适培养基配方。

1.3.5 培养方法将培养基拌匀后装入24 cm×12 cm聚丙烯塑料袋中，松紧适度，装至塑料袋2/3处，用无棉盖体将袋封口，每个水平装5袋。将装好的培养基塑料袋经高压蒸汽灭菌后，在无菌条件下接入10 mL的球孢白僵菌孢子液，在温度为25℃、空气相对湿度为60%～70%的无光条件下培养至孢子成熟。

1.4 产孢条件优化

1.4.1 不同培养温度对产孢量的影响选用优化后的培养基配方，按上述方法装袋、灭菌、接种后，把菌袋分别放入温度为18、20、22、25、27、29℃的条件下下，空气相对湿度为60%～70%，无光条件下培养至孢子成熟。考查孢子形成的最适培养温度。每个水平装5袋。

1.4.2 不同空气相对湿度对产孢量的影响选用优化后的培养基配方，按上述方法装袋、灭菌、接种后，把菌袋分别放入空气相对湿度为65%、75%、80%、85%、90%、95%的条件下，在适宜温度及无光条件下培养至孢子成熟。每个水平装5袋。

1.5 产孢及孢萌发测

从每个菌袋的袋口处称取50 g含有孢子的培养基，放入105℃的电热恒温干燥箱中烘干1 h，粉碎后制成粉剂。取1 g球孢白僵菌干粉参照国家标准GB/T25864-2010[8]测定产孢量及孢子萌发量，每个样品重复3次。

1.6 数据分析

采用Excel、SPSS软件统计分析试验数据[9-10]。

2 结果与析

2.1 产孢养基方优

2.1.1 不同主要原料对产孢量及孢子萌发量的影响以5种主要原料配制培养基进行产孢培养，测定其产孢量及孢子萌发量。由图1可知，在其他营养成份和培养条件不变的情况下，主要原料不同的培养基产孢量不同，5种主要原料配制的培养基产孢量依次为B>C>D>E>A，选择B为主要原料配制的培养基球孢白僵菌产孢量及孢子萌发量最高，产孢量达1.483×1011个/g，孢子萌发量达1.429×1011个/g；其次为主要原料C配制的培养基，产孢量为1.464×1011个/g，孢子萌发量为1.389×1011个/g。可知，以B为主要原料配制的培养基是球孢白僵菌产孢最适的培养基，主要原料为2种以上配制的培养基产孢量均高于单一主要原料A配制的培养基产孢量。

图1 不同主要原料产孢量及孢子萌发量

2.1.2 不同速效有机碳源对产孢量及孢子萌发量的影响选用B为主要原料配制的培养基，按1.3.1方法进行速效有机碳源优化试验，测定产孢量及孢子萌发量。由图2可知，4种速效有机碳源配制的培养基产孢量依次为葡萄糖>蔗糖>果糖>麦芽糖>乳糖，以葡萄糖为速效有机碳源配制的培养基球孢白僵菌产孢量及孢子萌发量最高，产孢量达1.632×1011个/g，孢子萌发量达1.589×1011个/g；其次为以蔗糖为速效有机碳源配制的培养基，产孢量为1.483×1011个/g，分生孢子萌发量为1.429×1011个/g。以乳糖为速效有机碳源配制的培养基产孢量及孢子萌发量最低。

图2 不同速效有机碳源产孢量及孢子萌发量

2.1.3 不同氮源对产孢量及孢子萌发量的影响选用B为主要原料，以葡萄糖为速效有机碳源配制的培养基，按1.3.2方法进行氮源优化试验，测定产孢量及孢子萌发量。从图3可以看出，5种氮源培养基产孢量依次为蛋白胨>酵母粉>鱼粉>NH4NO3>尿素。以蛋白胨为氮源配制的营养基球孢白僵菌产孢量及孢子萌发量最高，产孢量达1.632×1011个/g，孢子萌发量达1.589×1011个/g；其次为酵母粉为氮源配制的培养基，产孢量为1.587×1011个/g，孢子萌发量为1.536×1011个/g。以尿素为氮源配制的培养基产孢量及孢子萌发量最低。

图3 不同氮源产孢量及孢子萌发量

2.1.4 不同无机盐对产孢量及孢子萌发量的影响选用B为主要原料，以葡萄糖和蛋白胨为速效有机碳源和氮源，按1.3.3方法进行无机盐优化试验，测定产孢量及孢子萌发量。由图4可知，6种不同无机盐配制的培养基产孢量依次为CaSO4+KH2PO4>K2HPO4+MgSO4>K2HPO4>CaSO4>CaSO4+MgSO4>MgSO4。以CaSO4+KH2PO4为无盐配制的培养基球孢白僵菌产孢量及孢子萌发量最高，产孢量为1.663×1011个/g，孢子萌发量为1.601×1011个/g。以MgSO4为无机盐配制的培养基产孢量及孢子萌发量最低。

图4 不同无机盐产孢量及孢子萌发量

2.2 培养基适宜配方优化试验

正交试验设计如表1所示，培养配方正交试验结果如表2所示。由表2可知，球孢白僵菌培养基最适配方为A3B3C2D2E4，即玉米糠83%+麦麸14%、葡萄糖1.5%、蛋白胨1.0%、K2HPO40.5%、CaSO41.5%。从极差R可知，培养基中各组分对产孢量影响的主次因素依次为A主料>B葡萄糖>ECaSO4>DK2HPO4>C蛋白胨。

表1 L16（45）培养基配方正交试验因素及水平

表2 L16（45）培养基配方正交试验结果

2.3 验证试验

为了验证正交试验最优组合的产孢量及孢子萌发量，以A3B3C2D2E4配制的培养基，含水量调至60%，装10袋灭菌后接种培养，测定产孢量及孢子萌发量。测得A3B3C2D2E4配方的产孢量为1.784×1011个/g，孢子萌发量为1.736×1011个/g，萌发率为97.3%。

2.4 产孢条件优化

2.4.1 不同培养温度对产孢量及孢子萌发量的影响由图5可知，随着温度升高，球孢白僵菌产孢量及孢子萌发量逐渐升高，温度为26 ℃时产孢量和孢子萌发量最高，产孢量为1.781×1011个/g，孢子萌发量1.733×1011个/g；当温度低于22 ℃时，产孢量及孢子萌发量较低；当温度超过26℃时，产孢量和孢子萌发量随温度升高呈下降的趋势。

图5 不同培养温度产孢量及孢子萌发量

2.4.2 不同空气相对湿度对产孢量及孢子萌发量的影响由图6可知，随着空气相对湿度升高，球孢白僵菌产孢量及孢子萌发量逐渐升高，当空气相对湿度为85%～90%时，产孢量及孢子萌发量最高；当空气相对湿度超过90%时，产孢量及孢子萌发量呈下降的趋势。

图6 不同空气相对湿度产孢量及孢子萌发量

3 结论讨

球孢白僵菌菌剂产孢量及孢子萌发量是鉴定球孢白僵菌菌剂质量的重要指标。在菌剂生产过程中球孢白僵菌产孢量及孢子萌发量受营养条件和环境条件的影响。关于球孢白僵菌培养基及培养条件的研究已有一些报道，例如陈孟等[11]以大米为培养基对其产孢条件进行优化；王爽等[12]对球孢白僵菌菌株固化培养基及产孢条件进行研究；张亚平等[13]对球孢白僵菌液体培养营养需求及培养条件进行研究可知，球孢白僵菌在不同的培养基质上产孢量及孢子萌发量不同。而生产球孢白僵菌菌剂需采用固体培养基进行培养，通过本研究优化的球孢白僵菌菌剂适宜的配方为米糠83%+麦麸14%、葡萄糖1.5%、蛋白胨1%、K2HPO40.5%、CaSO41.5%，以此为培养基质球孢白僵菌产孢量及孢子萌发量均达到球孢白僵菌剂的国家标准，并且所用原料来源广、易得、成本低。

温度和空气相对湿度是影响球孢白僵菌菌剂产孢量及孢子萌发量重要的环境因素，通过本研究确定生产球孢白僵菌的适宜温度为26℃、空气相对湿度为85%～90%时，产孢量及孢子萌发量最高。在试验过程中发现当空气相对湿度超90%时，容易发生其他霉菌污染，对球孢白僵菌菌剂的质量有较大影响。本研究仅对生产白僵菌菌剂的培养基配方及温度和空气相对湿度重要的环境因素进行了研究与探讨，而对生产所获得的球孢白僵菌孢子粉剂的毒力影响因素并没有涉及，对球孢白僵菌毒力的影响因素还需深入研究和探讨。