玉米大斑病抗病鉴定谷物粒培养基产孢因素探讨

蒙 成，黄艳花，梁庆平，蒋益敏，吴 地

(广西农业职业技术学院，广西南宁 530007)

【研究意义】玉米大斑病(Northern leaf blight of corn)是玉米的一种重要叶部病害，在我国各地普遍发生，对玉米产量影响严重，一般可导致减产20%左右，严重时减产可达50%［1－4］。该病害由玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)引起，病菌可通过分生孢子实现病害远距离传播［5］。利用抗病种质资源，选育和种植抗病品种是控制玉米大斑病流行的有效措施［6］。在抗病品种选育过程中，必须进行抗病性鉴定接种。孢子悬浮液喷雾接种和粉碎玉米病叶接种，受降雨和环境相对湿度影响较小，是开展玉米大斑病抗病性鉴定较好的人工接种方法。大田进行抗病性鉴定接种需要大量接种体，因此，探索影响分生孢子产生的外界条件，从而获得大量分生孢子对玉米大斑病抗病性接种鉴定具有十分重要的意义。【前人研究进展】在抗病品种的选育与利用过程中，抗病性鉴定已成为玉米育种及其区域适应性的常规工作。玉米大斑病抗病性鉴定常用方法有:把保存的玉米大斑病菌接种在PDA斜面上，待产生大量孢子后用无菌水配成孢子悬浮液喷雾接种［7］;采用高粱粒培养基培养玉米大斑病分生孢子做接种体，然后放入玉米心叶内接种［8－11］;也有把玉米大斑病病叶粉碎撒在玉米心叶内接种［12－13］;刘烨珏等［14］研究结果表明，菌液灌心和带菌高粱粒接种可以保证玉米单株接种量一致，同时，接种体被接种于玉米心叶中，保证了玉米大斑病菌孢子萌发所需的水分和湿度，提高病菌侵染率;分生孢子在不同营养及培养环境条件下，其产孢效果差异显著。沈江卫等［15］研究结果表明:甘薯黑斑病菌(Ceratocystis fimbriata Elliset Halsted)在番茄培养基上生长最好，在胡萝卜培养基上生长最差;分生孢子产量以在PDA培养基上最多，在玉米粉培养基上最少;菌丝适宜生长温度25℃，在15℃下分生孢子产孢量最大;光照条件对黑斑病菌分生孢子产孢量没有明显差别。刘海英等［16］认为继代培养一般会引起微生物退化，但也不排除使微生物增强适应性的可能。利用谷物粒(麦粒，玉米粒，高梁粒等)培养基制备接种体是目前病害接种中广泛使用的方法之一。玉米大斑病分生孢子通常采用高粱粒培养基来培养［17］，但产孢效果不甚理想，且在实际操作中，制备的接种体往往存在污染率高、滋长小昆虫、制备慢和操作过程复杂等缺点。冯胜泽等［18］和姜开梅等［19］利用其他平板培养基来做产孢实验，但这些产孢方法操作过程繁琐，不便于大面积抗病鉴定操作，不能用带病菌组织进行接种。目前，关于玉米大斑病利用谷物粒培养基培养分生孢子，并对其产孢影响因素进行研究尚未见报道。【本研究切入点】为获得产孢效果好、成本低且操作简单、便于进行大面积抗病性鉴定。以高粱粒、小麦粒、玉米粒为主要材料，以玉米叶、甘露醇、碳酸钾、硫酸镁、磷酸钠等为辅料，组配25种植物组织培养基开展产孢量试验，同时对温度、培养时间、光照、同一菌株不同代数等影响产孢因素进行探讨。【拟解决的关键问题】对影响玉米大斑病抗病鉴定谷物粒培养基产孢因素进行探讨，寻找一种谷物粒培养基及其培养方法，在玉米大斑病抗病鉴定时获得产孢效果好、成本低且操作简单、便于进行大面积抗病性鉴定，可以用带病菌谷物粒进行接种，为玉米大斑病抗病鉴定工作的简化性、时效性、准确性提供保障。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

在玉米大斑病集中发生期，从田间采集具有典型玉米大斑病症状的叶片进行病菌分离:在PDA培养基上进行单病斑分离(第1代)，经纯化后(第2代)进行单孢子分离(第3代)，获得野生型玉米大斑病菌菌株，即为供试菌株。

1.2 供试培养基

供试培养基，分别由高粱粒、小麦粒及玉米粒为主要材料，以甘露醇、碳酸钾、硫酸镁、磷酸钠、玉米叶等为辅料，单因素组配25种培养基。高粱粒处理方法:挑选籽粒饱满、大小一致、无病虫的带皮高粱水煮25 min后水洗沥干备用;小麦粒处理方法:挑选籽粒饱满、大小一致、无病虫的带皮小麦粒浸泡20～25 min后，水煮15～18 min后水洗沥干备用;玉米粒的处理方法为:挑选大小一致、无病虫的玉米粒侵泡12～15 h，水煮1h，水洗沥干备用;玉米叶用从大田采集新鲜嫩叶切成约1 cm2的碎片备用;培养基制作方法:按配方配置，把所需成分混匀，湿度以药品能溶解，玉米叶能掺和在籽粒上而无滴水为度。配好的培养基装入250 mL的三角瓶中(简称培养瓶，下同)，每瓶装100 g，经121 Pa高压灭菌45 min备用。

1.3 供试仪器

供试培养箱为珠江牌培养箱，型号:LRH-250-GSB1。

1.4 不同培养条件对分生孢子产量的影响

1.4.1 培养基对分生孢子产量的影响 单因素组配25种植物组织培养基进行产孢量试验，每个配方一个处理，共25个处理(表1)，3次重复。供试菌株在PDA培养基上扩繁6 d，菌丝长满9 cm培养皿后，用带PDA培养基的菌丝接种到供试谷物粒培养基上，每份处理接种半皿菌块(下同)，接种后的培养瓶置于20℃、12 h黑暗12 h光照(光照强度2000 lx)的培养箱中培养11 d，测定产孢量。

1.4.2 温度对分生孢子产量的影响 以9号培养基为供试培养基，分别在 8、12、16、20、24、28、32 和36 ℃共8 个温度梯度［20］、光周期:12 L∶12 D(光照强度2000 lx)条件下培养，3次重复，培养11 d后测定产孢量。

1.4.3 光照条件对分生孢子产量的影响 以9号培养基为供试培养基，分别在24 D、12 L∶12 D(1500、2000、3000 lx等3种不同光照强度梯度)、24 L(光照强度3000 lx)共5种不同光照处理下20℃恒温培养 11 d［18］，3 次重复。

1.4.4 培养时间对分生孢子产量的影响 以9号培养基为供试培养基，接种后的培养瓶分别置于20℃和24℃、12 L∶12 D光照(光照强度2000 lx)条件培养箱中培养，3 次重复。于第 5、7、9、11、15、20 和25 d测定产孢量。

1.5 供试菌株不同代数对分生孢子产量的影响

将供试菌株(第3代)的菌块移植在PDA平面培养基上(即为第4代)，置于25～26℃温箱中培养，同时移植在PDA斜面培养基上作为分代保存菌种。每一代培养7 d时用菌块继代转移1次，连续对菌株进行菌块继代移植和培养，可获得该病菌的继代培养菌种，共移植到第10代，斜面培养基保存的分代菌种培养7 d后放入4℃进行保存［21］。试验时将3～10代的菌种做试验处理，以9号培养基为供试培养基，8个处理，3次重复。接种后的培养瓶放入20℃、12 h黑暗12 h光照(光照强度2000 lx)条件下培养11 d后测定产孢量。

1.6 分生孢子产量的测定

取各处理菌粒2 g放入50 mL烧杯加水10 mL，用不绣钢勺子连续搅拌约100次，以保证能将菌株所产生的分生孢子刮下至孢子脱落水里，过滤得到的孢子悬浮液，用血球记数板计算1 mL孢子悬液中所含的孢子数，折算每g培养基产生的孢子量。每处理取样3次，每样品读数3次。

表1 25种供试培养基Table 1 25 tested media

图1 不同培养基对产孢量的影响Fig.1 The effect of different media on conidia production

2 结果与分析

2.1 不培养基对产孢量的影响

将供试菌株分别接种在25种不同培养基上，培养11 d后观察发现每种培养基上均有分生孢子产生，但其产孢量不同。由图1可知，18个不同配方的培养基产胞量显著高于对照，配方小麦100 g+甘露醇2.5 g+玉米叶15 g的9号培养基产孢数量最多，为1.69 ×105个/g;配方玉米100 g+甘露醇2.5 g+碳酸钾0.2 g+玉米叶15 g的20号培养基产孢量次之，为1.49 ×105个/g;排第 3、4、5、6、7 的分别为5、3、11、12、19 号培养基，产孢量分别为 1.28 ×105、1.18 × 105、1.13 × 105、1.13 × 105、1.09 × 105个/g;14号与22号培养基产孢量相当，分别为7.20×104、6.18 ×104个/g;17、6、8 号培养基产孢量相同，其与13、21、2、15号培养基产孢量相当，产孢量依次为 2.17 × 104、3.63 × 104、3.44 × 104、2.61 ×104、2.29×104个/g;1号和24培养基产孢量相同，产孢量为1.02×104个/g;25号常用高粱培养基(CK)产孢量为9.10 ×103个/g;10、7、18、16、23、4 号培养基产孢量较对照少，分别为8.92×103、8.92×103、5.10 × 103、3.18 × 103、2.55 × 103、2.00 × 103个/g。因此，9号培养基为玉米大斑病菌分生孢子产生的最佳培养基。

图2 不同温度对产孢量的影响Fig.2 The effects of different temperatures on conidia production

2.2 不同温度条件对产孢量的影响

由图2可知，培养温度对玉米大斑病菌分生孢子产生的影响较大，温度过低或过高都不利于分生孢子产生。20℃条件下产孢量显著高于其它，24℃条件下产孢量其次，温度≤8℃或≥32℃时，不产生分生孢子。因此，接种后的培养基在20℃条件下培养是玉米大斑病菌分生孢子产生的最适宜温度。

2.3 不同光照条件对产孢量的影响

图3 光照对产孢量的影响Fig.3 Effects of light treatments on conidia production

图4 不同培养时间对产孢量的影响Fig.4 The effects of different culture duration on spore production

由图3可知，光照条件对玉米大斑病菌产孢量有一定影响，适量光照对该病菌产孢有促进作用。12 L∶12 D，2000 lx光照强度条件下产孢量显著高于其它光照条件，产孢量为1.69 ×105个/g;12 L∶12 D，光照强度1500 lx条件下产孢量次之，产孢量为1.41×105个/g;高强度光照即12 L∶12 D，光照强度3000 lx条件对该病菌产孢量有明显抑制作用，产孢量为2.7×104个/g;24D条件下不利于产孢，产孢量为8.99×104个/g;24 L，光照强度为3000 lx条件下最不利于产孢，产孢量仅为1.71×104个/g。

2.4 不同培养时间对产孢量的影响

由图4可知，培养时间对玉米大斑病菌产孢量影响差异显著。20和24℃条件下培养时间7～11 d，培养时间越长，产孢量显著增加，20℃条件下培养11 d产孢量最多;培养时间11～25 d，培养时间越长，产孢量显著减少。因此，在20℃条件下，培养时间在第11天是玉米大斑病菌分生孢子产生量最多的时间。

2.5 供试菌株不同代数对产孢量的影响

由图5可知，玉米大斑病菌经菌块继代转移和培养，不同代数对产孢量影响差异显著。产孢量随着代数增加而递减。第3代产孢量最高，为1.69×105个/g;第 4 代其次，产孢量为 1.36 ×105个/g;因此，第3代菌株最有利于玉米大斑病菌分生孢子生长，产孢量最多。

3 讨论

图5 菌株不同代数对产孢量的影响Fig.5 Effects of different strain generations on the conidia yield

在促进植物病原真菌产孢的研究进程中，方中达［22］认为培养基与孢子产生的关系最大，采用不同培养基或者改变它们的成分，是促进孢子产生的最主要途径;刘丽丽等［23］认为不同培养基对多数茄链格孢的产孢量有明显影响;庄义庆等［24］认为绿豆汤培养液是蕉斑镰刀菌液体摇瓶产孢最好的培养液，在适宜条件下，产孢量达到1×106mL－1;兰成忠等［25］认为辣椒疫霉菌在胡萝卜、黑麦和燕麦培养基均能产生孢子囊，胡萝卜培养基上产生孢子囊的数量最多;冯胜泽等［18］用13种不同培养基诱导玉米大斑病菌分生孢子的产生，发现使用玉米籽粒葡萄糖琼脂培养基(CDA)、玉米籽粒琼脂培养基(CA)及水琼脂培养基(WA)3种培养基产孢量较低，均≤8.89×103个/mL，PDA 培养基产孢量为 1.32 ×105个/mL，而玉米叶片葡萄糖琼脂培养基(CLDA)最有利于分生孢子的产生，产孢量达到 1.63×105个/mL，使用含有玉米叶片的CLDA培养基与使用普通PDA培养基相比产孢量差异显著。本研究采用25种不同谷物粒培养基诱导玉米大斑病菌分生孢子产生，发现使用配方为小麦100 g、甘露醇2.5 g、玉米叶15 g的9号培养基最佳，产孢量最多，产孢量为1.69 ×105个/g;配方为玉米 100 g、甘露醇 2.5 g、碳酸钾0.2 g玉米叶15 g的20号培养基其次，产孢量第二，产孢量为1.49×105个/g，说明，这两种培养基搭配合理，适宜玉米大斑病菌生长。

陈利峰和徐敬友［26］研究结果表明，玉米大斑病菌分生孢子形成温度为13～30℃，产孢最适温度为20℃;冯胜泽等［18］认为培养温度过低或过高都不利于分生孢子的产生，在15、35℃均不产生分生孢子，仅在20、25、30 ℃能够产生孢子，其中在 20、30℃的产孢量较少，25℃为病菌分生孢子产生的最适宜温度。本研究认为:玉米大斑病菌在温度≤8℃或≥32℃时，不产生分生孢子;16～24℃产孢量较多，其中20℃条件下产孢量最多。说明，培养温度过低或过高都不利于玉米大斑病菌生长，低于8℃或32℃以上病菌停止生长。

光照条件对玉米大斑病菌生长影响差异显著，本研究发现，在全光照培养条件下(光照强度3000 lx)显著抑制分生孢子产生;12 h黑暗12 h光照培养条件与全黑暗培养相比，光照强度3000 lx抑制分生孢子产生，光照强度2000 lx促进分生孢子产生;连续24 h黑暗条件下不利于分生孢子产生。说明在玉米大斑病菌中不同光照强度对分生孢子产生的影响不同。由此可见，在不同植物病原真菌中，光照时间、光照强度、光质等对病菌分生孢子产生均具有不同程度影响，本研究结果与冯胜泽等［18］研究结果基本一致。

培养时间对玉米大斑病菌产孢量差异显著。以配方小麦100 g、甘露醇2.5 g、玉米叶15 g的培养基在20和24℃条件下，培养7～11 d、培养时间越长，产孢量显著增加;培养11～25 d培养时间越长，产孢量显著减少。因此，该配方的培养基在20和24℃条件下，培养时间11 d是玉米大斑病菌分生孢子产生量最多的时间。其它配方的培养基，其产孢量与培养时间关系是否与该配方培养基相一致，有待进一步研究。

本研究结果玉米大斑病菌经菌块继代转移和培养，第3代产孢量最多，从第3～10代产孢量随着代数增加而递减。刘海英等［16］研究认为，经连续单孢分离和培养，获得玉米大斑病菌的22次继代培养菌株，前13代菌株没有明显的生长和发育变化，从第14代开始，继代培养对病菌的生长和发育存在显著影响，随着继代次数增加，产孢量下降，本研究结果与其研究结果差异较大，原因可能是连续单孢分离和培养与菌块继代转移和培养相比，菌株衰退较慢;也有可能两者间供试的菌株本身存在较大的差异。

4 结论

利用单因素组配确定了促进玉米大斑病菌分生孢子产量增加的最佳谷物粒培养基配方为小麦100 g、甘露醇2.5 g、玉米叶15 g的9号培养基;该培养基在20℃、光暗交替各12 h，光照强度为2000 lx条件下，分生孢子产量最高;培养时间在11 d内，培养时间越长产孢量越高，第11天是玉米大斑病菌分生孢子产生量最多的时间，培养时间11～25 d，培养时间越长，产孢量越少;玉米大斑病菌经菌块继代转移和培养，第3代产孢量最多，从第3～10代产孢量随着代数增加而递减。