基于网络药理学研究吴茱萸治疗结直肠癌作用机制

王 娟， 李 超， 徐 靖

结直肠癌近年来发病率明显升高，严重威胁人类健康。中医药常作为结直肠癌手术、放化疗外的补充和替代治疗，疗法注重扶正祛邪和阴阳平衡[1-2]。中药治疗结直肠癌的临床应用广泛，可缓解临床症状，改善患者生存质量，延长生存期，降低术后复发转移，缓解化疗副反应，逆转药物耐药等。吴茱萸为芸香科植物，多项研究证实吴茱萸及其活性成分具有抗肿瘤作用。吴茱萸碱对多种肿瘤细胞,如宫颈癌[3]、卵巢癌[4]、胃癌[5-6]、胰腺癌[7]、肝癌[8]、胶质瘤[9]等具有肿瘤抑制作用。小檗碱通过JAK1-STAT3信号通路抑制膀胱癌细胞增殖[10]。槲皮素在乳腺癌[11]、前列腺癌[12]、肺癌[13]、食管癌[14]等多种肿瘤中发挥抑制癌细胞增殖侵袭，促进凋亡作用。吴茱萸的抗肿瘤作用机制尚未阐明，仍需进一步研究。本文运用网络药理学研究及生物信息学分析，构建吴茱萸-靶点-结直肠癌的中药调控网络，揭示吴茱萸作用于结直肠癌的活性成分，作用靶点及信号通路，研究吴茱萸抗结直肠癌机制，为临床药物应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 吴茱萸活性成分筛选及活性成分靶点获取 基于中药系统药理学数据库（TCMSP）数据库（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）[15]， 检 索吴茱萸的活性成分；设定口服利用度(OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18进行筛选。进一步应用TCMSP数据库筛选吴茱萸活性成分的作用靶点，基于UniProt数据库（http://www.uniprot.org/）[16]对作用靶点进行校正注释，整理并去重后得到活性成分对应靶点。

1.2 吴茱萸抗结直肠癌潜在靶点预测 通过GeneCards数据库（https://www.genecards. org/）[17]获得结直肠癌相关疾病靶点。对结直肠癌相关疾病靶点与吴茱萸主要活性成分作用靶点取交集，应用R语言（R 3.6.3，软件包ggplot2）绘制韦恩图。

1.3 构建吴茱萸抗结直肠癌蛋白互作网络 将筛选得到的结直肠癌相关疾病靶点与吴茱萸主要活性成分潜在作用靶点的交集靶点导入STRING数据库（https://string-db.org）[18]，物种设定为“Homo sapiens”，置信度设置为0.9，对作用靶点进行蛋白互作分析。使用Cytoscape 3.8.0软件进行PPI网络绘制，使用Cytoscape 3.8.0软件网络拓扑分析插件cytoNCA分析各网络节点的度值(degree)、介度中心性(betweenness centrality，BC)、接近中心性(closeness centrality，CC)指标。

1.4 吴茱萸抗结直肠癌靶点生物功能分析及通路分析 差异靶点富集分析，包括基因本体（gene ontology，GO）富集和信号通路（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 富集。GO 富集分析可以了解差异基因的分子功能（molecular function，MF）、参与的生物过程(biological process，BP)及细胞中的定位（cellular component，CC）。应用 R 语言（R3.6.3，软件包clusterPro filer）[19]对预测靶点进行GO分析和KEGG信号通路富集分析，应用R语言（R 3.6.3，软件包ggplot2）进行可视化绘图。

2 结果

2.1 吴茱萸活性成分筛选以及靶点的筛选 通过TCMSP数据库检索吴茱萸的活性成分，设定OB≥30%和DL≥0.18筛选，获得化合物30个，包括吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸卡品碱、吴茱萸酰胺、棉花皮素、番石榴苷、小檗碱、槲皮素、异鼠李亭、谷甾醇、β-谷甾醇等。进一步应用TCMSP数据库获得活性成分对应的作用靶点，整理去重后得到活性成分对应靶点198个。

2.2 吴茱萸抗结直肠癌靶点的筛选 通过GeneCards数据库获得结直肠癌相关的靶点8599个。对结直肠癌相关疾病靶点与吴茱萸活性成分作用靶点取交集获得吴茱萸治疗结直肠癌潜在靶点162个，应用R语言（R 3.6.3，软件包ggplot2）绘制韦恩图（图1）。

图1 吴茱萸-结直肠癌共同基因靶点韦恩图

2.3 蛋白互作网络分析 研究吴茱萸治疗结直肠癌潜在作用靶点的功能和作用机制，将筛选得到的共有靶点导入STRING数据库，物种设定为“Homo sapiens”，置信度设置为0.9，对作用靶点进行蛋白互作分析。使用Cytoscape 3.8.0软件进行PPI网络绘图（图2A），使用Cytoscape 3.8.0软件网络拓扑分析插件cytoNCA分析各网络节点的度值(degree)、介度中心性(betweenness centrality，BC)、接近中心性(closeness centrality，CC)指标（表1），取度值前10个靶点为核心靶点（图2B），包括AKT1、TP53、MAPK1、JUN、HSP90AA1、RELA、TNF、EGFR、ESR1、MYC。

图2 蛋白相互作用网络图（PPI）

表1 吴茱萸抗结直肠癌核心靶点及拓扑参数

2.4 GO分析和KEGG分析 应用R语言（R 3.6.3，软件包clusterPro filer）对预测靶点进行GO分析，在满足 padj＜0.1 & qvalue＜0.2条件下，BP共有2471条，CC共有90条，MF共有195条；在满足padj＜0.05 & qvalue＜0.2条件下，BP共有2233条，CC共有73条，MF共有171条。选取P值最小的前4名条目建立气泡图（图3A）和网络图（图3B）。分子功能分析（MF）得到结果包括泛素蛋白连接酶结合，调节类固醇受体活性，调节转录因子活性，调节核受体活性等。富集度较高的生物学过程(BP)主要涉及细胞对脂多糖的反应，细胞对氧水平的应答，对细菌来源分子的反应，缺氧反应等。

图3 GO富集分析

应用R语言（R 3.6.3，软件包clusterPro filer）对预测靶点进行KEGG分析，在满足padj＜0.1& q value＜0.2条件下，KEGG共有173条；在满足 padj＜0.05 & qvalue＜0.2条件下，KEGG 共有161条。依P值倒序排列，排名前面的肿瘤相关信号通路条目建立气泡图（图4A）和网络图（图4B）。排名靠前的信号通路包括PI3K-Akt信号通路，AGE-RAGE信号通路，MAPK信号通路，癌症中的蛋白多糖，细胞衰老，TNF信号通路，松弛素信号通路，细胞凋亡，HIF-1信号通路，雌激素信号通路，铂类耐药，EGFR酪氨酸激酶抑制剂抵抗，P53信号通路等。

图4 KEGG信号通路富集分析

3 讨论

中医认为恶性肿瘤是由于身体内部阴阳失衡所引起，环境、禀赋、七情、饮食起居等原因导致体内“正气”亏虚，“邪气”聚集，发生癌变。结直肠癌的发生、发展及转归过程是正邪相争的结果。当“邪气”强盛于“正气”，疾病进展，患者即出现临床症状。中药抑制肿瘤进展的作用包括：抑制肿瘤细胞增殖侵袭，诱导肿瘤细胞凋亡，提高和恢复机体免疫功能，增强化疗药物疗效，逆转细胞株耐药等。Lai等[20]研究发现，龙葵提取物可通过降低MCF-7抑制肿瘤细胞增殖，并上调Caspase-3诱导乳腺癌细胞凋亡。三叶草提取物抑制肺癌细胞A549侵袭转移是通过下调MMP-2、MMP-9表达及上调TIMP-2表达[21]。消癌平注射液通过降低乳腺癌细胞中ATF-3的表达，促进肿瘤细胞凋亡、抑制细胞迁移和侵袭[22]。梁颖等[23]研究了益脾活血方促进肝癌术后免疫功能的恢复，通过降低B7-H1表达，消减对T淋巴细胞活化的抑制，纠正负性免疫调节。小檗碱与顺铂联合应用逆转胃癌的多药耐药，其机制是通过下调P-gp、MRP蛋白表达，并上调caspase家族蛋白表达，诱导癌细胞凋亡[24]。

本文对吴茱萸的抗结直肠癌作用机制进行探讨。应用网络药理学方法筛选出吴茱萸活性成分30个，包括生物碱类，如吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸卡品碱、小檗碱等；以及黄酮类，如槲皮素、异鼠李亭、棉花皮素等。这些活性成分涉及198个靶点，其中162个与结直肠癌相关，证实了吴茱萸具有抗结直肠癌作用。这种多活性成分，多靶点中药涉及的作用机制复杂，既往研究多为单一靶点、通路研究证实吴茱萸的抗结直肠癌作用。吴茱萸碱抑制人结肠细胞的增殖迁移。石雪萍等[25]认为机制是通过下调HDAC3来影响NF-κB及p53蛋白的表达抑制增殖和迁移。李海星等[26]则认为是通过抑制SIRT1的表达，激活NF-кB信号通路，进而抑制MMP-9抑制结肠癌细胞增殖和迁移。陈海青等[27]应用脂多糖处理人结肠癌上皮细胞制备炎症损伤模型，吴茱萸碱能逆转此炎症损伤，上调紧密连接蛋白表达，维持肠上皮屏障完整性。常金荣等[28]研究了对细胞周期的影响，认为盐酸小檗碱和吴茱萸碱通过靶向miRNA-17-92抑制E2F1蛋白表达，阻滞细胞分裂分化，进而抑制癌细胞增殖。体内实验显示，吴茱萸碱对炎症相关性结直肠癌具有良好的预防作用，其作用机制可能为降低组织炎症水平以及抑制癌细胞异常增殖[29]。方剂左金丸和反左金丸皆由黄连和吴茱萸组成，主要成分为吴茱萸碱和小檗碱，通过抑制癌细胞激活及生长，诱导细胞凋亡起到抗肿瘤作用[30-31]。致癌剂1, 2-二甲基酰肼(DMH)诱导大鼠大肠癌实验模型中， 左金丸有效阻碍早期大肠癌的发生和发展[32]。钱平等[33]阐述了左金方的抗胃肠肿瘤作用及吸收、代谢和药物代谢动力学等体内过程的研究进展。连黛胶囊是在左金丸方中加了青黛，中药物配伍关系为：小檗碱为君，青黛为臣，吴茱萸碱为佐使。连黛胶囊临床治疗胃癌、大肠癌有显著疗效，其可能机制为抑制ras基因的激活和阻止野生型p53基因突变从而抑制胃肠肿瘤进展[34]。杨传标等[35]研究探讨了连黛胶囊治疗胃肠肿瘤与中医证型的关系，发现临床应用中对热毒(湿热)证疗效最优。吴茱萸及其活性成分吴茱萸碱、小檗碱等目前临床主要应用于调节胃肠道功能，保护肠道屏障，减少肠道有害菌群数量等，其抗肿瘤作用还聚焦于细胞学研究和动物实验，临床应用并不广泛。既往研究说明吴茱萸治疗肿瘤不是依赖于单一的靶点及信号通路，各环节研究未能完整统一。因此，吴茱萸抗结直肠癌的药物开发及临床试验的开展需要更详细深入的机制研究。课题组利用网络药理学分析及生物信息学分析预测吴茱萸对结直肠癌起作用的潜在靶点及信号通路，发现吴茱萸抗结直肠癌核心靶点包括AKT1、TP53、MAPK1、JUN、HSP90AA1、RELA、TNF、EGFR、ESR1、MYC等。主要涉及通路包括PI3K-Akt信号通路，AGE-RAGE信号通路，MAPK信号通路，癌症中的蛋白多糖，细胞衰老，TNF信号通路，松弛素信号通路，细胞凋亡，HIF-1信号通路，雌激素信号通路，铂类耐药，EGFR酪氨酸激酶抑制剂抵抗，P53信号通路等。这些核心靶点及关键通路的研究有待于后续实验进一步验证。

吴茱萸抗瘤谱广且高效低毒，其抗肿瘤活性的研究已取得了部分成果，然而目前临床应用仍不多。更进一步的表型及机制研究将为临床用药提供支持，期望将来吴茱萸作为结直肠癌辅助治疗的天然抗癌新药应用于临床，提高患者生活质量及生存期。