凉血活血方通过抑制NLRP3炎性小体活化保护脓毒症急性肺损伤小鼠的实验研究

卓玉珍， 杨 磊， 鹿燕敏， 李棣华， 刘俊红， 李彩霞， 崔立华， 钟成梁

急性肺损伤(ALI)是一种严重的肺部炎症性疾病，其病理机制复杂，是多种通路参与的炎性反应过度激活引起的肺部疾病[1]。有多项研究发现核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎性小体参与ALI的病理过程，抑制其活化可以改善急性肺损伤[2-4]。此外，核转录因子κB（NF-κB）和信号传导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)也参与ALI的病理过程。凉血活血方适用于多种腹腔感染性疾病。本研究通过观察其对脓毒症ALI小鼠NLRP3炎性小体、NF-κB、STAT3等信号通路的影响，探索凉血活血方对ALI的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 72只雄性C57BL/6小鼠，6～8周龄，体质量为20 g，购自北京华阜康生物科技有限公司，合格证号SCXK（京）2014-0013。饲养于SPF 级动物房，饲养环境为室温20～25 ℃，相对湿度为40%～60%，光照时间为12 h/12 h明暗交替。实验期间动物自由饮食饮水，实验前动物适应性饲养至少1周。

1.1.2 实验药物及试剂 凉血活血方由红藤18 g，丹皮9 g，赤芍6 g，延胡索6 g组成，饮片购自安国市普天和中药饮片有限公司（执行标准《中国药典》2015年版一部）。参照《医用实验动物学》，按人与小鼠之间的用药剂量换算，小鼠的剂量（mg/kg）=W(动物与人体的每公斤体质量剂量折算系数)×人的剂量(mg/kg)，查表得W=9.01，小鼠以20 g体质量计算。水煎提取：饮片加入10倍量的水，浸泡30 min，水沸后煎30 min，纱布粗滤取滤液；残渣加10倍量的水再煎煮30 min，过滤；合并两次滤液，通过减压旋转蒸发仪回收溶剂，制成0.5 g/mL浓缩液。装瓶密封放于4 ℃备用。白细胞介素（IL）-6、IL-1β、肿瘤坏死因子（TNF）-α炎性因子ELISA试剂盒购自武汉爱博泰克生物科技有限公司。髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。GAPDH、NF-κB、P-NF-κB、P-STAT3、STAT3、ASC和NLRP3抗体购自美国CST公司，Caspase1 p20、IL-18、IL-1β购自美国Abcam公司。

1.1.3 实验仪器 酶标仪（上海科华实验室系统有限公司），垂直电泳转印系统及全自动多功能化学发光分析系统（美国伯乐公司）。

1.2 方法

1.2.1 急性肺损伤模型制备、分组及给药 将雄性的C57BL/6小鼠72只随机均分为3组：假手术组、模型组和凉血活血方组。采用盲肠结扎穿孔法（cecal ligation and puncture, CLP）建立脓毒症肺损伤的动物模型。具体方法为：术前进食不禁水12 h。麻醉备皮，下腹部正中切口，找到盲肠，在结肠根部和盲肠末端中点穿4.0编丝缝线，仅系盲肠，避免损伤盲肠动脉；之后在盲肠末端和缝合线中点处，用21G针头自系膜缘横穿盲肠，撤针后挤出一小滴肠内容物，还纳盲肠，关腹。假手术组麻醉后仅开腹翻动盲肠。凉血活血方组灌胃给予凉血活血方水煎剂（6 g/kg）连续2 d（1次/d），第2次给药2 h后开始造模，模型组及假手术组给予同等体积生理盐水灌胃。术后给予食水继续饲养，24 h后麻醉取材。由于后期检测标本较多，实验分不同批次进行。一批实验取肺泡灌洗，用于收集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluids，BALF)。一批实验取肺组织用于湿/干重比（W/D）检测。最后一批实验，左侧肺组织用于病理检测，右侧肺组织用于检测MPO和相关蛋白表达。

1.2.2 HE染色观察肺组织病理改变 将肺叶固定于10%福尔马林24 h后，乙醇梯度脱水，石蜡包埋，切片（厚度4 μm），常规HE染色，光学显微镜下观察，采集图像。肺组织损伤评分参考文献[5]。

1.2.3 小鼠肺组织W/D测量 取新鲜肺组织，称量各组小鼠左肺重量，记为肺湿重，置于70 ℃烘箱烘烤约48 h至恒重，再次称重记录，记为肺干重。W/D=肺湿重/肺干重。

1.2.4 小鼠肺组织MPO含量检测 取新鲜肺组织后，先进行冲洗：将左心耳剪开，用2.5 mL注射器抽取2 mL冰PBS，插入右心室进行冲洗，肉眼可见肺脏颜色变白即可，冲洗结束，取肺组织按试剂盒说明进行MPO测定。

1.2.5 ELISA法检测BALF中炎性因子含量 将小鼠麻醉后，颈部脱毛消毒，用眼科剪纵向剪开颈部皮肤肌肉，充分暴露气管，在气管上切一倒置T型口进行插管，用1 mL注射器向气管内缓慢注射预冷的PBS，洗2遍，每遍0.8 mL，每遍冲洗3次，回收液即为支气管肺泡灌洗液。将灌洗液在1 500 r/min，4 ℃条件下离心15 min，取上清分装于EP管中，冻存于-80 ℃备用。按照试剂盒说明书用ELISA法检测上清TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。

1.2.6 Western blotting 检测肺组织NLRP3炎性小体、NF-κB、STAT3信号通路相关蛋白表达 取-80 ℃保存的肺组织约35 mg，以1:10比例加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的蛋白裂解液(RIPA)，组织匀浆机冰上充分匀浆，充分裂解1 h后，4 ℃条件下以12 000 r/min离心15 min，取上清即为组织蛋白液，BCA试剂盒测定蛋白浓度，最后加入上样缓冲液，金属浴加热变性。肺组织上样量每孔60 μg，经SDS-PAGE胶分离蛋白，电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗4 ℃过夜。第2天洗膜后加入二抗，2 h后洗膜，ECL显色成像。蛋白相对表达量以目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值表示。

1.3 统计学分析 数据应用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料以表示，比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色观察小鼠肺组织病理变化 HE染色发现模型组小鼠的肺组织出现明显的病理改变：肺泡结构紊乱，肺泡腔塌陷、融合或数目较少，肺泡壁增厚，肺间质水肿，毛细血管充血或出血，肺泡腔和肺间质有大量炎性细胞浸润。假手术组肺组织结构相对完整，有少量炎细胞浸润，肺泡腔清晰可见。与模型组相比，凉血活血方组肺组织病理改变明显减轻，肺泡结构破坏减少，水肿减轻，炎细胞浸润也减少。模型组肺组织损伤评分高于假手术组，凉血活血方组肺组织损伤评分高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 各组小鼠肺组织病理变化（HE，×100）

2.2 小鼠肺组织MPO含量的变化 与假手术组比较，模型组肺组织MPO的含量明显升高，经过凉血活血方治疗后可以明显降低其含量，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠肺组织MPO活性及W/D比值比较

2.3 小鼠肺组织的W/D比值变化 模型组小鼠肺组织W/D比值明显高于假手术组（P＜0.05），凉血活血方可以明显降低肺组织W/D比值，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.4 小 鼠 BALF中 TNF-α、IL-1β、IL-6含量的变化 造模24 h后，与假手术比较，模型组BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6均显著升高（P＜0.05），经过凉血活血方治疗能够明显降低这些炎性细胞因子含量，减轻肺组织的炎症损伤，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组小鼠BALF中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量比较

2.5 小鼠肺组织NLRP3炎性小体、NF-κB、STAT3信号通路相关蛋白表达的变化 模型组小鼠肺组织中NF-κB、STAT3蛋白磷酸化水平高于假手术组（P＜0.05），而凉血活血方能够明显降低其磷酸化水平，抑制活化（P＜0.05）。另外，NLRP3炎性小体在脓毒症肺损伤小鼠的肺组织中被激活，相关蛋白包括NLRP3、Caspase 1 P20、ASC、IL-18、IL-1β表达水平升高（P＜0.05），经过凉血活血方治疗后可以降低这些蛋白的表达水平，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 各组小鼠肺组织NLRP3、ASC、Caspase-1 P20、IL-1β、IL-18、P-NF-κB和P-STAT3蛋白表达的变化

3 讨论

脓毒症是机体由于感染引起的免疫反应，是重症患者常见的并发症[6]。ALI是脓毒症最常见的并发症之一，在中医学里并没有对应的病名，但对其症状有相关的论述，并且认为它病位在肺，可以累及全身器官。对于本病的发病机制，祖国医学认为是内因与外因共同作用的结果。“热”“毒”是它的发病基础，毒邪犯肺又可导致“痰”“瘀”等病理产物，进一步加重病情和加速疾病进展[7]。在治疗方面以凉血解毒、活血化瘀为主。凉血活血方全方四味药，红藤清热解毒兼活血，为君药；丹皮清热凉血，泻热破瘀，为臣药；赤芍凉血活血为佐药，延胡索化瘀止痛为使药。综观全方，可以清热、解毒、散瘀。前期研究发现：凉血活血方可以改善脓毒症大鼠肠屏障功能，降低血浆内毒素水平，减少术后肠粘连，其有效组分还可促进脓毒症大鼠肠道血流及组织氧供的改善[8-10]。但其对脓毒症肺损伤的作用和机制仍不清楚。本研究采用CLP制备ALI小鼠模型，观察了凉血活血方对脓毒症肺损伤小鼠的保护作用和可能的机制。本研究发现，CLP建立的ALI模型24 h后小鼠肺组织出现明显的病理学改变，肺组织水肿，中性粒细胞等炎性细胞浸润。经凉血活血方干预后，肺组织的病理损伤得到明显改善；肺组织MPO活性降低，中性粒细胞浸润减少；肺的湿/干重比明显降低，肺组织水肿减轻；由于各种炎性细胞浸润，肺泡腔内各种炎性因子分泌增加，模型组BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎性因子水平升高，凉血活血方可以明显降低其水平，减少肺组织的炎症损伤。这些研究结果可以说明凉血活血方对脓毒症肺损伤有明显的保护作用，能够减轻ALI的损伤程度。

炎性小体是机体应对微生物入侵和破坏信号而形成的存在于细胞质的大分子复合物[11]。NLRP3炎性小体作为研究比较广泛的炎性小体，其核心蛋白NLRP3激活后招募接头蛋白ASC，二者相互作用进一步招募激活pro-Caspase-1，pro-Caspase-1诱导自身蛋白水解剪切为活化的Caspase-1。Caspase-1能够引起促炎细胞因子IL-1β和IL-18前体的成熟活化。随后消皮素D（gasdermin D，GSDMD）导致细胞膜孔形成，细胞发生肿胀、裂解及死亡，同时IL-1β和IL-18大量释放[12-13]。有研究发现，在脂多糖诱发的ALI小鼠模型中，NLRP3炎性小体被激活，IL-1β和IL-18等炎性因子水平升高，通过抑制其活化可以明显减轻肺组织损伤，增加小鼠存活时间，体外实验也可以观察到同样的现象[14-15]。本研究发现造模24 h后与对照组比较，模型组中NLRP3、ASC、Caspase-1 P20、IL-1β 和 IL-18表达明显增加，肺组织损伤严重，给予凉血活血方后可以降低这些蛋白的表达，提示该方通过抑制NLRP3炎性小体活化从而减轻肺组织损伤。

NF-κB和STAT3是两个重要的转录因子，在脓毒症ALI中有重要作用。NF-κB调控多种炎症基因、生长因子的表达，在多种炎症疾病中发挥重要作用[16-17]。其被激活后转移到细胞核中，引起下游基因转录增加，促进炎性因子过度表达，加速肺损伤进程。STAT3主要存在于胞浆中，是多种炎症介质在细胞内传递信号的途径[18]，本研究前期也发现STAT3在ALI小鼠肺组织中被激活，磷酸化水平升高，抑制其活化可以减轻肺组织炎症损伤[19]。本研究也观察了凉血活血方对脓毒症ALI小鼠肺组织NF-κB和STAT3蛋白的调节作用，结果发现凉血活血方可以明显抑制它们的活化，从而减轻小鼠肺组织炎症损伤。

综上所述，凉血活血方可以通过抑制NLRP3炎性小体激活和NF-κB、STAT3通路的活化，从而抑制下游相关炎性因子的释放，减轻脓毒症ALI肺组织炎症反应和损伤，这也许是凉血活血方防治脓毒症ALI的作用机制之一。