紫黄生肌膏对慢性感染创面血管生成及血管内皮生长因子和血管生成素-1表达的影响

杨 筱， 吴本升， 何宗琦， 杨建华

肛门直肠疾病的治疗方法主要以手术治疗为主，切口多为开放性创面，加之术后粪便刺激，导致切口变为慢性感染创面，愈合时间较长。江苏省名老中医黄礼主任中医师将名方“生肌玉红膏”进行化裁，结合其临床经验和药理学研究，依据“煨脓长肉”法，组成中药复方制剂紫黄生肌膏，临床观察其具有良好的促进肛肠手术创面愈合效果[1]。前期实验已证实紫黄生肌膏可以通过下调肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-6抑制炎症反应，促进创面修复[2]。本实验旨在通过建立慢性感染创面模型，应用紫黄生肌膏治疗，观察创面新生毛细血管数量，检测创面肉芽组织血管内皮生长因子（VEGF）、血管生成素-1（Ang-1）的表达。VEGF和Ang-1都是促进血管生成的重要因子，它们不但能促进新生血管的生成，还具有促进血管内皮细胞增殖的功能，本研究旨在观察紫黄生肌膏对慢性感染创面血管生成的作用。

1 材料与方法

1.1 实验药物 紫黄生肌膏：紫草15 g，大黄10 g，白芷15 g，甘草30 g，当归30 g，血竭12 g，珍珠粉6 g，白蜡60 g，麻油500 g。由苏州市中医医院制剂室按药物制剂规范加工成药物油膏纱布。用时根据创面情况将紫黄生肌膏纱条剪成大小合适的纱条。贝复济即重组牛碱性成纤维细胞生长因子（rb-bFGF），国药准字S19991021（规格为63000 IU/15 mL/瓶），珠海亿胜生物制药有限公司生产，实验全过程使用同批号药物。粪液的制备：正常人新鲜粪便10 g，加生理盐水5 mL，充分混均匀，离心机离心，取其上清液，每天现配现用。

1.2 实验动物 雄性SD大鼠84只。上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，实验动物生产许可证：SCXK(沪）2017-0005。

1.3 主要仪器及试剂 苏木素-伊红染液试剂盒（江苏凯基生物科技发展有限公司，KGA224）；光学显微镜（Olympus，BX41）；台式恒温振荡器（中国，上海精宏实验设备有限公司，THZ-312）；Rat-VEGF（上海酶联ml002862）；Rat-Ang-1（上海酶联ml002916）。

1.4 模型制备 参照付小兵等[3]的造模方法，加以改进而形成综合造模法，制作大鼠背部人粪污染慢性感染创面模型。将大鼠随机分为4组，分别为空白组、模型组、贝复济组、紫黄生肌膏组。腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，备皮区用碘伏常规消毒，在脊柱两侧距脊柱2 cm处用直径1.8 cm橡皮印章定位后切割直径1.8 cm的圆形创面2个，创面深达肌层，肌层伤口厚度约0.3 cm，压迫止血。充分止血后，空白组创面涂生理盐水1 mL，其余3组在创面涂粪液约1 mL，以油纱、敷料、绷带固定。实验动物自由进水、觅食，48 h后去除覆盖物，观察创面见伤口有黄脓性分泌物，有粪臭味者为造模成功。

1.5 实验分组 按照随机数字表法将已编号的大鼠分成四组：空白组21只、模型组21只、贝复济组21只和紫黄生肌膏组21只。

1.6 给药方法 造模成功后第2天，按照组别及分组方案开始用药，除空白组外，其余各组每天换药前0.5 h在创面涂抹粪液1 mL，保持0.5 h后统一换药，用药前均常规清洁创面。空白组：不涂粪液，用生理盐水清理创面；模型组：涂抹粪液，用生理盐水清理创面；贝复济组：涂抹粪液，用贝复济（60 U/cm2）浸润的纱布敷在创面上；紫黄生肌膏组：涂抹粪液，用紫黄生肌膏（0.2 g/cm2）浸润的纱布敷在创面上。每组均每天换药一次。

1.7 观察指标 各组大鼠在每次换药前，观察大鼠皮肤创面呈现的颜色、创面有无渗出物、水肿程度和肉芽组织生长情况等；分别记录第3、7、14天各组大鼠创面大小，计算创面面积。用药后第3、7、14天分批次随机处死5只大鼠，取大鼠创面中心至创缘部分的肉芽组织，约0.5 cm×0.5 cm大小，常规石蜡切片处理。HE染色后观察肉芽组织在光镜下新生微血管的数量，取3个随机视野里微血管数量的平均值，用ELISA法测定肉芽组织中VEGF、Ang-1的表达。

1.8 统计学方法 数据应用SPSS22.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（ ）表示，多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 创面观察 84只大鼠造模48 h内死亡4只，其中模型组死亡2只，贝复济组和紫黄生肌膏组各死亡1只。空白组大鼠创面渗血、渗液少，肉芽组织生长旺盛，创面愈合速度最快。模型组大鼠创面渗血、渗液较多，每日换药需清理较多分泌物，肉芽组织生长缓慢，创面凹陷，愈合速度最慢。贝复济组、紫黄生肌膏组大鼠创面渗血、渗液较少，水肿消退较快，肉芽组织生长旺盛，创面愈合速度较快。见图1。

图1 各组大鼠用药后第3、7、14天创面愈合情况

2.2 创面面积比较 用药后第3天，模型组创面缩小慢于贝复济组和紫黄生肌膏组，差异有统计学意义（P＜0.01），第7和14天，紫黄生肌膏组创面缩小明显加快，优于贝复济组，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表 1。

表1 各组大鼠创面面积比较

2.3 创面肉芽组织新生毛细血管数量比较 用药后第3天，各组大鼠创面新生毛细血管数量较少，其中模型组与贝复济组、紫黄生肌膏和正常组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；用药后第7和14天，各组创面新生毛细血管增多，紫黄生肌膏组和贝复济组新生毛细血管数量增长较模型组快，差异有统计学意义（P＜0.01），其中紫黄生肌膏优于贝复济组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组创面肉芽组织新生毛细血管数量的比较

2.4 创面肉芽组织VEGF表达比较 用药后第3天，模型组VEGF含量显著低于紫黄生肌膏组及贝复济组，差异有统计学意义（P＜0.01）；用药后第7天，各组创面的VEGF均呈上升趋势，紫黄生肌膏组高于贝复济组，差异有统计学意义（P＜0.01）；用药后第14天，各组创面的VEGF都下降，但紫黄生肌膏组创面VEGF含量仍高于贝复济组，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表3。

表3 各组创面肉芽组织VEGF表达的变化

2.5 创面肉芽组织Ang-1表达比较 用药后第3天，紫黄生肌膏组及贝复济组Ang-1含量显著高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.01）；用药后第7天，各组创面的Ang-1均呈上升趋势，但模型组增势较其余三组慢，紫黄生肌膏组高于贝复济组及模型组（P＜0.01）；用药后第14天，各组创面的Ang-1都下降，但紫黄生肌膏组创面Ang-1含量仍高于贝复济组，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表4。

表4 各组创面肉芽组织Ang-1表达的变化

3 讨论

肛门直肠手术一般采用开放性创面，容易引发感染，从而减缓肉芽生长[4]，所以需重视术后创面的清洁换药。此类慢性感染性创面愈合一般分为四期，分别为凝血期、炎症期、修复期、成熟期。其中1～3 d天为凝血期，3～7 d为炎症期，创面边缘逐渐红肿，创面渗出类似脓液的分泌物，此阶段会发生一系列的反应，如纤维蛋白溶解、炎性细胞浸润、免疫应答及复杂的血管反应，从而清除创面上的坏死组织，为伤口修复和再生提供良好的条件；术后7～21 d为修复期，逐渐形成肉芽组织，其中成纤维细胞、新生血管、内皮细胞是构成肉芽组织的主要成分，并有部分上皮再生覆盖创面[5]。

肉芽组织填充是创面愈合的关键，其中血管再生及血管网的形成有极其重要的作用，新生血管可以为创面细胞提供营养和氧气。缺氧可诱导早期血管生成细胞因子分泌，如VEGF是促进创面愈合的重要因素。VEGF可以通过促进炎性细胞进入损伤部位，刺激内皮细胞增殖和迁移，从而促进血管生成。此外，VEGF还能改善伤口的再上皮化和胶原脱位[6]。有实验研究发现，VEGF基因敲除小鼠缺乏血管内皮分化和血管形成，导致胚胎死亡[7]。血管生成素是酪氨酸激酶受体Tie-2的配体，其中Ang-1是Tie-2的激动剂，通过Tie-2信号通路在血管生成和创伤愈合中发挥重要作用。血管周细胞强烈表达Ang-1，并在皮肤创伤愈合后期向成熟的微血管募集，促进血管封闭和成熟[8]。缺乏Ang-1的小鼠由于产生渗漏的血管而早期死于出血[9]。VEGF和Ang-1有协同作用，有实验发现同时使用VEGF、Ang-1的海绵，在第7天即形成新生血管结构和血管平滑肌，并且新生血管密度保持稳定，而使用单一因子的海绵中新生血管管径小，结构不稳定[10]。

本实验通过观察四组大鼠创面愈合情况，研究紫黄生肌膏对慢性感染性创面血管生成及血管内皮生长因子和Ang-1表达的影响作用。紫黄生肌膏组大鼠创面在第7天就明显小于模型组及贝复济组。光镜下可见第3天紫黄生肌膏组有较多新生血管生成，第7天创面有大量新生的毛细血管，血管内径较大，伤口周围表皮细胞向伤口中心延伸蔓延，第14天仅有少量炎性细胞浸润，肉芽组织已逐渐成熟为纤维结缔组织，细胞间胶原纤维逐渐增多。同时VEGF、Ang-1在第3天就显著增加，说明紫黄生肌膏启动创面修复迅速，在第7、14天仍增长迅速，高于模型组和贝复济组。结果提示紫黄生肌膏能够有效上调VEGF、Ang-1的表达，促进创面新生血管形成，从而加速慢性感染性创面的修复。

对于慢性感染性创面，中医称之为“疮疡”，病机以瘀、虚为主，各种致病因素作用于局部，使气血凝滞、经络阻塞，若不能及时内消外解，则郁而化热，热盛肉腐，蒸酿成脓。《医宗金鉴》有云：“谓腐不去则新肉不生，盖以腐能浸淫好肉也；……若遇气虚之人，则惟恃药物以化之，盖去腐之药，乃疡科之要药也。”意为对于腐肉不去、新肉不生的创面，应当先使用去腐之品，使疮疡内蓄之毒早日排出，腐去之后方可生肌[11]。江苏省名老中医黄礼主任中医师根据《外科启玄·明疮疡宜贴膏药论》的“煨脓长肉”理论，将名方生肌玉红膏化裁为紫黄生肌膏，去其毒性较强的轻粉，加入大黄和珍珠粉，更添解毒敛疮之功。紫黄生肌膏方中大黄、紫草凉血解毒、清热逐腐，可使创面气血运行通畅，得以濡养充分，可有效促使创面“煨脓”，从而保持湿润。现代药理学研究证实大黄、紫草有抗菌、抗炎作用[12-13]，有研究证实大黄素能通过促进VEGF生成修复大鼠烫伤创面，并且与浓度相关。当归、血竭、白芷补血活血，化瘀止血，敛疮生肌[14]。药理学研究证实当归多糖能够增加巨噬细胞吞噬能力[15]，并促进血小板聚集而止血[16]，血竭可以上调皮肤移植模型大鼠血管内皮细胞生长因子、表皮生长因子和羟脯氨酸的表达[17]，白芷可以通过下调FOXO1/Ang-2通路促进新生血管形成与成熟[18]。珍珠粉消肿止痛，结合甘草调和诸药，攻补兼施。紫黄生肌膏涂于纱布条上，覆盖慢性感染性创面，促使创面局部气血通畅、濡养旺盛，有效改善局部血液供应，保持旺盛的代谢修复状态，促进伤口愈合，此法即为“煨脓长肉”。

朱朝军等[19]提出慢性感染性创面煨脓长肉过程中的“药疮交互作用”，即煨脓长肉之品不但能够促进创面VEGF等生长因子释放，而且药物作用于创面，促进分泌物生成，包含许多有效成分，例如Zn、Cu等，有效成分被创面活性细胞吸收利用，以补充创面局部营养物质的缺乏。受到物质、能量补充的活性细胞会主动地释放信号以主动摄取营养物质，由被动变主动，促使更多药物有效成分释放，从而促进创面愈合。由此可见，紫黄生肌膏不仅能通过上调VEGF、Ang-1的表达，促进创面肉芽生长，还能改善创面微环境，使机体保持旺盛的代谢修复状态。创面愈合过程复杂，仍需进一步探究紫黄生肌膏促进慢性感染性创面修复的作用机制。