基于RAS/RAF/ERK信号通路探讨益气生肌合剂对压力性损伤大鼠创面微小血管生成的作用机制

肖思民， 徐凤英， 廖若夷

压力性损伤也称为褥疮或压力性溃疡[1]，尤其好发于老年卧床患者，严重降低了患者的生存质量，亦给其身心带来着巨大的痛苦[2]。在多年的临床实践中应用益气生肌合剂在压力性损伤患者的创面修复中取得了显著稳定的疗效，但其具体机制仍需进一步证实。本实验研究以前期预实验为基础，根据模拟缺血再灌注法建立压力性损伤大鼠模型，基于RAS/RAF/ERK信号通路进一步探讨益气生肌合剂对压力性损伤大鼠模型创面修复及微小血管生成的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF清洁级雌性BALB/c大鼠32只，周龄为8～12周，体质量18～20 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司[动物许可证号：SCXK(湘 )2019-0004]。

1.2 实验药物 益气生肌合剂为湖南中医药大学第一附属医院院内制剂，具体药物组成：黄芪、党参、地黄、血余炭、当归、炉甘石、蜂蜜、紫草、白芷、地榆，由我院制剂室提供（批号：20210105，规格100 g/瓶）；三乙醇胺乳膏[法国bia fine act公司生产，注册号：（进）H20120425，规格：46.5 g/支 ]。

1.3 主要试剂与仪器 Ras、Raf-1、ERK1/2、VEGF一抗（美国Cell Signaling Technology公司）；PBS（美国Hyclone公司）；总RNA提取试剂盒、实时荧光定量PCR（RT-PCR）Ras、Raf-1、ERK1/2、血管内皮生长因子(VEGF)试剂盒（武汉博士德生物公司）；激光多普勒血流灌注散斑成像仪（瑞典Perimed公司）；电镜（德国LEICA公司）；摇床（江苏其林贝尔公司）、荧光定量PCR仪（美国Thermo公司）、电泳仪、转膜仪（北京六一仪器公司），其余实验试剂及仪器均由我院实验室提供。

1.4 压力性损伤大鼠模型的建立 使用戊巴比妥钠对大鼠进行麻醉（80 mg/kg），剃毛后选取大鼠右股薄肌部，参照以往研究构建缺血-再灌注的生理反应制备压力性损伤大鼠模型[3]，其中压力装置向大鼠施压模拟“缺血”过程(持续2.0 h)，释放压力模拟“再灌注”过程(持续0.5 h)，完整的“缺血-再灌注”制备压力性损伤大鼠模型循环需用时2.5 h，设置压力参数为34.7 kPa。所有大鼠均实施6个循环，以制备大鼠出现直径约1 cm的明显压力性红斑，同时30 min内按压不退色则视为压力性损伤大鼠模型制备成功。

1.5 动物分组与给药 随机将32只大鼠分为模型对照组、三乙醇胺乳膏组（阳性药物组）、益气生肌合剂组（益气生肌组）、三乙醇胺乳膏+益气生肌组（联合用药组），每组8只。根据人与实验大鼠体质量比例[4]计算，设定为12.98 g/（kg·d），使用生理盐水加热充分溶解益气生肌合剂，制备实验所用药液。三乙醇胺乳膏使用方法为2次/d。模型对照组大鼠通过灌胃针灌胃生理盐水0.4 mL；阳性药物组大鼠于创面均匀涂抹三乙醇胺乳膏；益气生肌组大鼠以上述制备的益气生肌合剂药液通过灌胃针灌胃0.4 mL；联合用药组为三乙醇胺乳膏外用+益气生肌合剂灌胃0.4 mL，均连续用药8 d。

1.6 观察指标及方法 第8天对大鼠采血，置于4 ℃的低温下以1 500 r/min离心5 min，血清置于-20 ℃冰箱待检。断颈处死大鼠，使用无菌仪器在大鼠创面受压中心部位肌肉组织取材约1 g，并进行HE染色。观察各组大鼠造模后及药物干预后第3、5、8天的创面面积及创面情况。用激光多普勒血流灌注散斑成像仪检测各组大鼠创面血流灌注量水平，计算各组大鼠的微血管密度(microvessel density，MVD)值。Western blotting及实时定量PCR检测创面受压中心部位肌肉组织中Ras、Raf-1、ERK1/2、VEGF等蛋白及mRNA的表达水平。

1.7 统计学方法 实验数据用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差（ ）描述，符合正态分布和方差齐性，采用完全随机设计多样本单因素方差分析；计数资料采用例（%）表示，比较用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组压力性损伤大鼠模型创面形态学观察及创面愈合率比较 干预8 d后，模型对照组大鼠仍可见压力性损伤性腐肉，创面潮湿，与之相比，阳性药物组、益气生肌组、联合用药组大鼠压力性损伤创面均呈明显愈合趋势，其中联合用药组愈合效果最佳（P＜0.05），见表1、表2及图1。

图1 造模第5天各组大鼠创面形态学观察

表1 各组大鼠创面情况比较

表2 各组大鼠创面愈合率比较

2.2 各组压力性损伤大鼠模型创面组织病理学情况 模型对照组大鼠受压中心部位组织存在大量的免疫细胞浸润，可见明显的肌肉纤维坏死碎片、空泡变性、肉芽组织杂乱增生、纤维肿大、横断、溶解等情况；其余组可见一定程度的免疫浸润，偶见受压部位组织纤维肿大、横断、溶解、空泡化等情况；联合用药组可见轻度免疫浸润以及少量的成纤维细胞，组织纤维断裂存在不同程度的改善，基本未见空泡化现象，见图2。

图2 各组大鼠组织病理学情况(HE， ×100)

2.3 各组压力性损伤大鼠模型血流灌注量及微小血管密度比较 造模第1天，各组大鼠模型的血流灌注量及微小血管密度无显著差异（P＞0.05），造模第8天，模型对照组的血流灌注量及微小血管密度显著小于其他组，其中联合用药组效果最佳，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠血流灌注量及微小血管密度比较

2.4 各组压力性损伤大鼠模型创面组织Ras、Raf-1、ERK1/2及VEGF的蛋白及mRNA表达情况 阳性药物组、益气生肌组、联合用药组均可显著促进大鼠皮损组织的Ras、Raf-1、ERK1/2及VEGF的蛋白表达及mRNA表达，且联合用药组效果最优，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3，表3，表4。

表3 各组大鼠创面组织Ras、Raf-1、ERK1/2及VEGF的蛋白表达水平比较

表4 各组大鼠创面组织Ras、Raf-1、ERK1/2及VEGF的mRNA表达水平比较

图3 Western blotting检测Ras、Raf-1、ERK1/2及VEGF的蛋白表达

3 讨论

压力性损伤大多因机体较长时间承受压力，日久则出现受压局部持续的缺血缺氧状态，肌肉皮肤失于滋养，导致气滞血瘀，加之重压摩擦破溃，终致反复感染[5]。临床表现多为局部红肿坏死溃疡，创面迁延难愈等[6]，严重降低了患者的行动及自理能力。本病多以气虚为本，蕴毒为标，其治疗总体原则为扶正祛邪，标本兼治[7]。本病较高的治疗及护理成本使患者家庭及社会负担沉重，针对本病发现新的、安全、廉价、高效的治疗手段已成为医学界的研究热点。

现阶段对压力性损伤进行的基础研究较少[8]。本病其因病变部位组织微循环已破坏殆尽，血运极差，创面难以快速愈合，不仅严重降低了患者的生活质量，亦给医护工作造成了极大的困难[9]。研究表明，RAS/RAF/ERK信号通路是参与组织损伤愈合过程的主要信号通路之一，其能够调控VEGF、VEGFR2的表达水平，贯穿于整个血管新生的过程，发挥至关重要的作用[10]。封悦等[11]研究显示，VEGF能够参与到压力性损伤修复愈合诸多细胞生物学功能之中，VEGF所参与的各种细胞功能需通过与其受体VEGFR进行结合才可发挥，其中最重要的调控信号通路之一是RAS/RAF/ERK信号通路。RAS/RAF/ERK信号通路可激活下游的VEGF途径，调控多种细胞因子调控压力性损伤的创面血管新生，促进调控血管内皮细胞的增殖与迁移[12-13]。因此研究该信号通路在压力性损伤及其生理状态下的具体作用机制，从而为本病治疗提供了新的思路及方法，是值得去尝试的重要研究方向。

益气生肌合剂是我院治疗压力性损伤的优秀院内制剂，其由名方补中益气汤化裁而来，功效益气托毒、活血生肌，针对压力性损伤气虚毒蕴的病因病机，可有效改善局部组织损伤，减轻炎症反应，促进组织修复，同时方中药物均为常见药物，方便易得，价位合理，操作简单，未发现明显的不良反应，因此适于基层临床应用。本研究结果表明，相对于单独使用三乙醇胺乳膏或益气生肌合剂，联合用药的效果更佳，亦显示出中西医结合治疗本病的独特优势。本次实验通过益气生肌合剂干预压力性损伤大鼠模型，结果显示益气生肌合剂能有效改善压力性损伤大鼠模型的创面损伤，缓解压力性损伤病理损害，有效促进大鼠创面的血流灌注量及微小血管生成，同时促进RAS/RAF/ERK信号通路Ras、Raf-1、ERK1/2、VEGF蛋白及mRNA的表达，并与三乙醇胺乳膏联合使用起到协同增效作用。提示益气生肌合剂可通过激活RAS/RAF/ERK信号通路并促进其相关蛋白表达，促进压力性损伤病理损害的修复，可为中西医结合治疗压力性损伤提供新的思路与方法。