肾乳头钙化斑形成过程引起的肾脏损伤

钟蛟 刘建和 刘浩然

肾乳头钙化斑，即Randall斑( Randall’s Plaques RP)，是晶体沉积的最终结果，在此之前肾髓质复合体早已开始形成矿物质聚集体。采用高分辨率显微X射线计算机断层扫描技术对非结石形成者的整个乳头进行可视化分析，在超过70%的受检者肾锥体内有矿物质沉积[1-2]。晶体沉积形成RP的过程中，晶体可通过炎症和氧化损伤等机制来引起不同程度的肾脏损伤，深入探究RP形成及进展的机制，可为肾结石防治提供新的方向。

一、什么是肾乳头钙斑

1937年Randall[3]首先发现肾乳头上皮组织下间质存在一种磷酸钙成分的钙化斑即Randall斑，进一步研究发现其为结石前病变，并提出游离颗粒学说和固定颗粒学说[4]。游离学说认为，肾小管过饱和尿液形成晶体阻塞集合管而形成Randall 栓(图1a)。其主要成分是磷灰石，可作为结石附着生长的锚点[5-6]。固定颗粒学说认为，RP为始发于Henle细环的基底膜，逐渐延伸至肾髓质的间质，最后沉积在肾乳头上皮下组织中的一种成分为磷灰石钙盐晶体(图1b)。当尿路上皮被破坏时，RP成为结石形成的基石[7]。虽然两种钙化斑初始病灶位置不同，但其成分几乎完全相同，可能是晶体形成过程中的两种沉积形式。这两种病变均可以在肾乳头表面看到，但促进斑块形成的原因尚不完全清楚。

图1a 肾小管过饱和尿液经成核生长聚集后阻塞集合管后形成Randall栓 图1b 晶体从Henle细环的基底膜开始逐渐延伸至肾乳头上皮下间质聚集形成RP

二、Randall斑的形成机制

肾乳头钙化斑的具体发病机制仍不清楚。Evan等[8-9]通过大量研究证实，Henle环基底膜参与Randall斑块形成。Khan等[10]推测肾乳头中的晶体沉积可能是从膜泡诱导成核开始的，他们发现，斑块形成与胶原蛋白、膜结合囊泡、胶原纤维钙化和囊泡内含晶体都相关。Carpentier等[11]认为，非晶体化碳酸钙是Randall斑形成的前体，不仅存在乳头表面，也存在肾组织中。Taguchi等[12]首次报道Randall斑块基因表达谱的研究，通过草酸钙结石病人钙斑及非钙斑组织全基因组测序，发现众多差异表达基因。钙斑组织中LCN2、IL1L、PTGS1、GPX3及MMP等基因表达上调，SLC12A1和NALCN基因表达下调，而这些基因可能通过丝裂原蛋白激酶和PI3K/Akt通路诱导肾损伤、血管收缩、氧化应激、巨噬细胞来促进Randall斑块的形成。这可能与晶体颗粒形成过程中引起细胞凋亡、肾脏损伤等密切相关。有趣的是，大多学者认为，RP起源于Henle细环的基底膜，由于这些研究大多都是乳头活检而来，对Randall斑形成的乳头近端了解甚少，Hsi等[1]采用高分辨率显微X射线计算机断层成像技术对人肾髓质切片进行显微X-射线成像，发现髓质复合体的外髓内近端晶体形成可促进远端RP形成。

此外，一些学者也认为，成骨转化学说和血管钙化学说是Randall形成的机制之一。尿路结石和动脉粥样硬化有许多共同的特征，动脉粥样硬化是一种类成骨反应，将RP与血管钙化进行比较，发现成分都是类似于骨成分的羟基磷灰石，故推测RP形成可能与局部缺氧等刺激肾乳头上皮细胞向成骨细胞转化有关[13]。Stoller等[14]提出的血管假说认为，湍流、相对缺氧和高渗的肾乳头血管壁易受到损伤，其修复过程类似动脉粥样硬化反应而导致肾乳头血管壁钙化，最终延伸至肾乳头成为结石形成的原始病灶 。

三、Randall斑形成过程中晶体诱导的肾损伤

1.晶体诱导的直接和间接细胞毒性晶体可以直接对细胞产生毒性作用，肾小管细胞可以吞噬小于10 μm的晶体进入细胞内形成直径吞噬小体，吞噬小体与溶酶体融合可消化部分晶体[15]。这一过程中将释放大量的钙离子到胞浆中从而触发细胞坏死[16]。相反，溶酶体不能消化的颗粒将破坏溶酶体膜的稳定性，导致溶酶体酶(如组织蛋白B)泄漏到胞浆中，通过裂解免疫细胞中的坏死凋亡抑制蛋白丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(RIPK1)来激活坏死凋亡[17]；研究发现，草酸钙、磷酸钙及胱氨酸等晶体可通过激活受体相互作用的 RIPK3和混合谱系激酶结构域(mixed lineage kinase domain-like MLKL)来杀死肾小管上皮细胞，而在敲除RIPK3或MLKL的小鼠则免受晶体诱导肾脏损伤[18]，证实RIPK3和MLKL是介导肾细胞损伤的重要通路。晶体也可以通过坏死性炎症间接引发肾小管细胞坏死，晶体诱导的细胞坏死导致危险相关的分子模式、高迁移率族蛋白1、组蛋白、线粒体DNA、去甲基化DNA和RNA、ATP、草酸和双链DNA释放到细胞外腔，这些因素可能通过与邻近细胞表面的死亡受体结合来诱导相邻细胞的程序性坏死(图1)[19-20]。例如，草酸盐(CaOx)晶体可直接损伤肾小管上皮细胞，导致ATP释放和K+外流，激活产嘌呤能2X7受体( P2X7R)，继而经还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和线粒体途径使细胞内ROS水平升高， ROS通过NLRP3炎症体来促进肾小管上皮细胞的炎症损伤[21]。此外，组蛋白在细胞外具有很强的碱性电荷，会破坏邻近活细胞的质膜，也会加重肾脏损伤。值得注意的是，研究发现,不同大小和形状的晶体可引起中性粒细胞坏死性凋亡，但晶体诱导的中性粒细胞坏死凋亡是否与RP形成有关，至今仍不清楚[22]。

2.晶体诱导的肾脏炎症损伤:如前所述，晶体通过改变线粒体功能，导致活性氧产生增加、溶酶体失稳、蛋白酶泄漏以及NLRP3炎症小体等导致肾小管细胞坏死，从而致危险相关分子模式的释放。晶体颗粒和危险相关分子也可激活Toll样受体(TLR)，触发树突状细胞和促炎巨噬细胞中炎症小体的形成。同时，肾小管细胞坏死诱导细胞因子、激动素和脂质介质的表达，进一步促进血管扩张、血管通透性、白细胞流入和补体激活，从而增强肾脏炎症，放大肾脏坏死性炎症(图2)，导致急性肾损伤(AKI)[17,23-24]；然而，晶体和/或坏死细胞碎片形成的管状管型也可暂时阻塞管腔，导致肾小球滤过率和尿量突然下降也可致AKI[25]。

NLRP3炎症小体是许多晶体引起炎症的激活机制，参与CaOx晶体诱导的肾损伤及其上游的调节，由NLRP3炎性小体激活导致的细胞死亡称为调节性细胞凋亡。晶体激活肾脏间质巨噬细胞和树突细胞中的NLRP3炎症小体分泌成熟IL-1β，从而直接引发肾脏炎症(图2)[19]。NLRP3炎性小体整合细胞内危险信号(K+外流、颗粒摄取、溶酶体溶解、ATP和ROS等)并激活Caspase-1，Caspase-1将pro-IL-1β裂剪接加工为具有活性的IL-1β，其释放将炎症信号传递给周围的实质细胞，从而扩大肾脏坏死性炎症[26-27]。同时，IL-1β通过其受体扩大后续炎症效应，IL-1R激活NF-κB依赖的细胞因子和趋化因子的表达将进一步增强肾脏炎症反应[28]。除了炎症小体激活外，一些晶体还可以通过其他途径引起炎症：如尿酸晶体直接与细胞膜结合，以不依赖受体的方式诱导细胞表面脂质分类和酪氨酸蛋白激酶Syk的炎症激活[29]。此外，一些炎性细胞因子(如TNFα)促使肾小管细胞坏死性调节，更是加重了草酸盐晶体诱导的AKI[18]。值得注意的是，NLRP3炎性小体具有非炎症性功能，可通过转化生长因子β受体信号介导肾纤维化[30]。

图2 晶体诱导坏死性炎症的分子机制

巨噬细胞(Mφs)是至关重要的先天免疫细胞，可在各种刺激下诱导成具有不同功能的表型，其在晶体沉积过程中发挥重要作用。研究表明,M1Mφ通过氧化应激促进晶体沉积，而M2Mφ可抑制炎症同时通过吞噬作用减少晶体沉积[31-32]，起到相互制衡作用(图2)。Liu等[33]研究萝卜硫素在体内外可能通过NRF2-miR93-φ/IRF1途径促进M2Mφ极化，抑制CaOx沉积所致的肾小管上皮细胞炎性损伤。有学者认为,肾小管内沉积的晶体是经伸展运动进入间质，被单核Mφs和成纤维细胞识别并吞噬包裹后形成结晶肉芽肿[34]，但晶体触发结晶性肉芽肿形成的分子机制至今尚不清楚。在一项高草酸饮食诱导的小鼠肾脏结晶研究中，用CSF-1诱导M2 Mφs可抑制小鼠肾脏晶体沉积[35]，有望用于RP形成的治疗。研究还发现，雄激素受体缺失通过改变miR-185-5p/CSF-1信号改变Mφs募集M2Mφ极化抑制肾内草酸钙晶体沉积[36]。

肾小管细胞吞噬晶体后，试图在吞噬溶酶体中消化这些晶体，吞噬过程中导致胞浆中钙离子释放、钙蛋白酶激活，继而促进IL-1α的释放，引发炎症。然而，较大和难以消化的晶体会导致溶酶体不稳定，导致胞浆中Cat-B释放；晶体直接损伤引起K+外流，经NADPH和线粒体途径使ROS增加，组织蛋白酶B和ROS激活NLRP3，引起成熟IL-1β的分泌。组织蛋白酶B裂解RIPK1，导致Caspase通路介导的细胞凋亡，或者在Caspase-8缺失的情况下导致RIPK3和MLKL介导的调节性细胞坏死，引起细胞释放各种与肾炎有关的分子和警报剂。同时，间质内可见树突状细胞和Mφs吞噬晶体，随后溶酶体失稳释放Cat-B和ROS，激活NLRP3炎性小体，诱导树突状细胞分泌成熟的IL-1β，触发IL-1受体(IL-1R)依赖的肾脏炎症。肿瘤坏死因子受体(TnFR)途径可激活NF-κB，促进炎症小体的激活，同时释放炎症因子和趋化因子。RIPK3和MLKL也可以激活NLRP3炎症小体。某些促炎细胞因子也可以诱导邻近活细胞中受调控的细胞死亡，从而建立一个坏死性炎症的自动放大环路。

Randall斑的形成是一个从微观到宏观的过程，在此期间，晶体引起不同程度的肾损伤，涉及多种不同的病理机制。晶体颗粒过饱和促进肾小管内的结晶，导致肾小管阻塞、肾小管上皮细胞损伤及间质炎症坏死，最终引起肾功能损伤。目前研究已发现,晶体性肾损伤炎症免疫微环境中相关治疗靶点，也有相应药物诞生，未来有望从源头上治疗和预防肾结石的发生发展。