甲状腺乳头状癌的基因变异与临床病理特点分析

李铃睿 宋俊龙 刘汉卿 孔德光 陈创

甲状腺乳头状癌(papillary thyroid cancer，PTC)分化良好，长期随访发现，高达25%的PTC出现复发[1]。BRAF、RAS、RET和NTRK等基因促进PTC形成信号通路的激活。TERT和Tp53与PTC的去分化和转移相关[2]。二代测序(NGS)以低成本对多种基因快速检测，同时筛选出基因变异的位点并进行定量分析。NGS技术可使更多的生物标志物运用到甲状腺癌(thyroid cancer，TC)的诊断、靶向治疗及预后评估中。本研究对34例PTC病人石蜡标本进行NGS检测，分析BRAF突变频率与PTC临床病理特征的关系。

对象与方法

一、对象

2015年3月～2021年5月我院手术治疗的PTC病人34例。26例行甲状腺腺叶切除+淋巴结清扫术，8例为甲状腺全切术后基于双风险评估的促甲状腺激素抑制目标予以治疗后复发[3]，且一次手术确诊为PTC，收集病人的基本资料及手术标本。肿瘤分期根据美国癌症联合委员会第8版术后TNM分期系统确定[4]。无病生存期(disease-free survival，DFS)定义为从手术开始到第一次复发确诊的时间。纳入标准：术后病理检查诊断为PTC；临床病理资料完整。排除标准：未检测到基因变异；合并其他恶性肿瘤。本研究已获得我院伦理委员会批准，病人均知情同意。

二、方法

1.文库制备和测序:杂交捕获测序法制备文库，利用NGS技术，检测70个TC相关基因的突变、插入、缺失或融合(表1)。首先，QIAamp DNA FFPE Tissue Kit提取TC福尔马林固定石蜡包埋样本的基因组DNA，Covaris M220超声波破碎仪对DNA进行片段化处理，然后进行末端修复、加“A”尾、连接测序接头和添加双端唯一标签。纯化后的文库通过探针靶向捕获，并用PCR对捕获的文库扩增富集，Qubit荧光定量仪测定浓度，同时使用Agilent 2100生物分析仪分析文库片段分布。制备好的质量合格文库在NovaSeq 6000测序平台上进行150bp双端测序。

表1 甲状腺癌70基因变异检测列表

2.生物信息学分析:Trimmomatic(v0.38)先去除双端测序reads的3＇ 端和5＇ 端的残留接头序列，接着VarScan(v2.3.9)程序对SNV/InDel进行分析，最后ANNOVAR和VEP进行基因变异注释。

三、统计学方法

结果

1.34例PTC病人的临床病理特点:34例PTC中有76.47%病人进行了原发灶的检测，平均年龄(35.96±12.79)岁；肿瘤最大径中位数为1.4 cm(范围0.4～5.0 cm)，促甲状腺激素范围为0.019～7.605 IU/ml，中位数为1.925 IU/ml(表2)。8例(23.53%)病人进行了复发灶检测，均为颈部淋巴结复发，年龄27～52岁，中位年龄37岁，男女各4例；DFS 2～66个月，平均25.38个月(图1)。

表2 26例原发性PTC的基本资料

2.34例PTC病人的基因变异情况：34例PTC共检测到BRAF、TERT、Tp53、NTRK3和RET 5种变异(图1)。合并2种及以上变异定义为多基因变异。26例原发灶中仅BRAF突变者19例，占原发性PTC变异的73.08%，突变位点为V600E，平均突变频率为(15.58±9.70)%；RET重排4例(15.38%)，2例为NCOA4型，位点为exon8-exon12，另2例为CCDC6型，位点为exon1-exon12；多基因变异2例(7.69%)，分别为BRAF V600E+TERT C250T+Tp53 E285K和BRAF V600E+ETV6-NTRK3；NTRK3融合1例(3.85%)，为ETV6型，融合位点为exon4-exon14；复发灶中仅BRAF突变者6例(75%)，突变位点均为V600E，平均突变频率为(16.43±14.14)%；RET重排1例(12.5%)，为NCOA4型，位点位于exon8-exon12；多基因变异1例(12.5%)，为BRAF V600E+TERT C228T。8例复发灶中未检测到NTRK3变异。

每一行代表1种基因或临床特征，每一列代表1例病人A：BRAF单基因变异的突变频率;B：基因变异种类及位点;C:基本临床特征图1 34例PTC的基因变异景观图

3.BRAF突变频率与临床病理特征的关系：原发灶中仅BRAF突变者19例，平均年龄(37.16±13.50)岁，突变频率1.14%～34.24%，中位数为13.61%，结合平均数，取15%为界值将病人分为低频突变组(≤15%)和高频突变组(>15%)，比较两组临床病理特征的差异。结果显示，高频组肿瘤更大(直径>2 cm，P=0.033)，多单个病灶(P=0.005)，低频组则相反。两组间性别、年龄、病理亚型、是否CLNM、是否ETE、TNM分期及是否合并HT等差异无统计学意义(表3)。

表3 BRAF突变频率与临床病理特征的关系(例)

讨论

多种基因参与PTC的发生发展，驱动基因的变异、富集及缺失使细胞异常生长、分化和凋亡。本研究原发灶共检测到包括多基因变异的4种变异，复发灶检测到3种，两组基因中BRAF平均突变频率分别为(15.58±9.70)% 和(16.43±14.14)%。有研究发现PTC原发灶与复发/转移灶的BRAF状态具有一致性[5-6]。Melo等[7]检测了180例PTC原发灶及转移淋巴结的BRAF、TERT及NRAS的突变频率，结果表明，三种突变频率在两组间具有一致性，尤其是BRAF突变。因此，BRAF、RAS和TERT可能在PTC复发转移中发挥作用，对手术不能切除的复发性PTC的后续治疗具有参考意义。本研究未获得复发灶对应的原发灶样本，未进行二者的相关性分析。

BRAF V600E是PTC最常见的基因变异，本研究中原发灶和复发灶均有此突变，原发灶中BRAF V600E患病率为80.77%，与既往报道相仿(29%～83%)[8]。目前，BRAF状态与PTC临床病理特征的相关性研究尚有争议，多数研究认为，BRAF突变是ETE、淋巴结转移及TNM晚期的危险因素[9]。Kim等[10]的研究表明，BRAF V600E突变比例高的PTC与肿瘤大小、ETE、淋巴结转移相关，突变比例低者临床行为与BRAF阴性肿瘤相似。本研究得到类似结果，PTC常具有多发小病灶的表现与低频组一致，而高频组多单个大病灶。de Biase等[11]和Guerra等[12]的研究均揭示了BRAF V600E阳性肿瘤细胞>30%(高突变者)的PTC体积大于<30%者(低突变者)，而后者进一步发现高突变者的复发比例明显高于低突变者。多项研究表明，BRAF V600E突变频率与ETE显著相关[13-14]，因此我们推测BRAF V600E突变的累积促进肿瘤的局部生长，进而影响病人预后。本研究未发现突变频率与ETE的关系，可能与纳入的样本较少且确诊年龄较小有关。

RET/PTC重排是甲状腺肿瘤发生的早期事件，以RET/PTC1(CCDC6-RET)和 RET/ PTC3(NCOA4-RET)最常见。前者在经典型中多见，而后者常与较大肿瘤、实性/梁状亚型和较晚TNM分期相关[15]。本研究中纳入RET/PTC1 2例，分别为实性/梁状亚型和经典型； RET/PTC3 3例，原发灶2例为经典型，复发灶1例。TERT主要为第228位点或第250位点的C到T突变。TERT突变与TC侵袭性有关，当远处转移时，BRAF、 TERT两种突变常同时存在[7]。本研究中原发灶和复发灶各1例检测到TERT突变，均为多基因变异，且原发性PTC病人病理亚型为TCV，部分去分化，肿瘤>4 cm，存在肌肉、神经侵犯和脉管癌栓。Tp53维持细胞正常生长， Tp53变异与TC的去分化相关[2,16]。本研究中仅原发组1例病人检测到Tp53突变，且合并BRAF和TERT突变。NTRK家族包括NTRK1， NTRK2和NTRK3三种融合，NTRK1融合比NTRK3更具侵袭性，二者均是预后不良的危险因素[16]。本研究在原发灶中检测到2例NTRK融合，其中1例合并BRAF突变。多数PTC仅存在单基因变异，多基因变异时可能激活多条信号通路，加速PTC发展。本研究中多基因变异在原发灶和复发灶中的比例分别为7.69%和12.50%。Trybek等[17]研究表明，BRAF V600E合并TERT突变与ETE、TNM Ⅱ～Ⅳ期、复发和较差的治疗反应相关。本研究因检测到上述基因变异的病人较少，尚未进行相关的临床分析。