代谢相关脂肪性肝病患者的血清胆汁酸谱研究

刘 倩 黄兰蔚 梅灿勇 沈晓萍 李 爽

代谢相关脂肪性肝病（MAFLD）的曾用名为非酒精性脂肪性肝病（NAFLD），目前全球的发病率高达25%[1]，亚太地区特别是中国的发病率逐年升高[2]。虽然饮食和运动习惯的改变及控制并发症仍是MAFLD防治的重要方法，但临床上通过改变生活习惯而成功降低体质量并起到治疗MAFLD作用的患者并不多见，改变生活习惯的措施在实施中存在较大的个体差异。目前可推荐的治疗MAFLD的理想药物非常有限[3]。研究表明胆汁酸代谢与MAFLD的发生、发展密切相关[4-5]，存在肝脏炎性反应的MAFLD患者的血浆和肝脏中的胆汁酸水平均高于正常值范围，提示该疾病的发展可能与胆汁酸引起的细胞毒性存在联系[6-7]。研究显示不同严重程度的儿童或成人MAFLD患者的胆汁酸谱之间存在显著差异，提示胆汁酸代谢紊乱可能增高了MAFLD患者的肝损伤风险[4-5]。目前研究的热点药物奥贝胆酸（OCA）为熊脱氧胆酸的半合成衍生物，临床研究表明其可提高2型糖尿病和MAFLD患者的胰岛素敏感度，并可减弱肝损伤标志物ALT的活性，这可能与其活化法尼酯X受体（FXR），间接抑制胆固醇7α-羟化酶（CYP7A1），从而抑制胆汁酸的合成有关[8-9]。因此，调节胆汁酸代谢对MAFLD患者的治疗具有重要的意义，而发现MAFLD患者与健康人群胆汁酸谱的差异对指导治疗药物的研发也显得尤为重要。目前对MAFLD患者胆汁酸谱分析的文献较少，本研究通过检测MAFLD患者的胆汁酸谱并分析胆汁酸谱与肝脏酶学指标、肝/脾CT值（肝脏密度CT值与脾脏密度CT值的比值）的相关性，初步探讨了胆汁酸谱改变在MAFLD疾病进程中的作用和 意义。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

选择2019年7月至2021年6月上海市宝山区中西医结合医院消化科收治的30例MAFLD患者设为MAFLD组，其中男性20例，女性10例，年龄25～65岁，平均年龄为（40.43±1.95）岁。纳入标准：（1）符合《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南（2010年修订版）》[10]中的诊断标准；（2）年龄18～65岁；（3）ALT＞正常值上限（男性＞30 IU/L，女性＞19 IU/L）且≤2倍正常值上限；（4）签署知情同意书。排除标准：（1）年龄＞65岁或＜18岁；（2）男性乙醇摄取量＞20 g/d，女性乙醇摄取量＞10 g/d；（3）ALT和（或）AST＞2倍正常值上限；（4）肝硬化、病毒性肝炎、自身免疫性肝病患者，或服用阿司匹林、四环素、胺碘酮、糖皮质激素、异烟肼、双氯芬酸钠等可导致脂肪肝的药物的患者；（5）近1年内曾接受胃肠减肥手术者；（6）近3个月内因服用减肥药物而使体质量降低＞10%的患者；（7）伴有心、肺、肾、内分泌、血液、代谢及胃肠道严重原发性疾病患者和精神疾病患者；（8）孕妇或哺乳期妇女。

此外，将在同期招募的本院职工及学生志愿者30人设为健康对照组，其中男性16人，女性14人，年龄20～65岁，平均年龄为（43.43±2.27）岁。本研究经医院医学伦理委员会审核批准（批件号：201809-05），所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 研究方法

收集两组的性别、年龄、ALT、AST、GGT、碱性磷酸酶（ALP）数据，并行上腹部CT检查以测算肝脏和脾脏密度CT值，计算肝/脾CT值。

胆汁酸谱由苏州帕诺米克生物医药科技有限公司检测，检测的胆汁酸谱包含39种胆汁酸，其中包括胆酸（CA）、鹅脱氧胆酸（CDCA）、甘氨胆酸、牛磺胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸等初级胆汁酸，以及脱氧胆酸（DCA）、石胆酸（LCA）、甘氨脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、甘氨石胆酸、牛磺石胆酸等次级胆汁酸。基于检测结果，对检测样本进行靶向定量，并根据定量结果进行相关数据分析。采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）技术检测所有样品，并对处理后的数据进行多元统计分析。为了筛选显著不同的代谢物，本研究采用正交-偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），OPLS-DA使用正交信号校正技术，将X矩阵信息分解为与Y相关和不相关的两类信息，然后过滤与分类无关的信息，相关的信息主要集中在第1个预测成分。之后再进行置换测试以评估OPLS-DA模型中是否存在过度拟合。本研究采用差异代谢物关联分析生成关联热图，从而研究各胆汁酸变化趋势之间的一致性，通过计算所有代谢物两两之间的Pearson相关系数或Spearman等级相关系数来分析各个代谢物之间的相关性。此外，为进一步分析两组间存在差异的胆汁酸是否与MAFLD相关，本研究选择肝脏酶学指标（ALT、AST、GGT、ALP）及肝/脾CT值与之进行Pearson相关性分析。

1.3 统计学分析

应用SPSS 19.0软件和GraphPad Prism 7.0软件进行统计学分析及作图。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验。肝脏酶学指标、肝/脾CT值与各差异胆汁酸的相关性采用Pearson相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组的临床资料比较

两组的性别、年龄差异均无统计学意义（P均＞0.05）。与健康对照组相比，MAFLD组的ALT、AST、GGT、ALP水平均显著升高，肝/脾CT值均显著降低（P均＜0.000 1）。见表1。

表1 两组的临床资料比较

2.2 两组的胆汁酸谱分析

OPLS-DA结果显示，MAFLD组与健康对照组的胆汁酸谱组成在不同区域分布（图1A）。之后进行置换测试以评估OPLS-DA模型中是否存在过度拟合（评估OPLS-DA模型是否存在过度拟合的标准是蓝色Q2点处的回归线与横坐标相交或＜0），结果显示不存在过度拟合（图1B），预测模型较为可靠。上述结果表明，MAFLD组与健康对照组的胆汁酸谱组成存在差异。

图1 MAFLD组和健康对照组胆汁酸谱的OPLS-DA分析 A OPLS-DA分析 B OPLS-DA 置换测试图

对两组的39种胆汁酸分别进行非参数检验，结果显示，与健康对照组相比，MAFLD组的7, 12-二酮石胆酸（7, 12-diketoLCA）、23-脱甲脱氧胆酸（NorDCA）水平均显著升高（P＜0.001，P＜0.05）（图2A、2B），牛磺脱氧胆酸钠盐（TDCA）、牛磺猪胆酸钠盐（THCA）水平均显著降低（P＜0.05，P＜0.01）（图2C、2D），两组的其余胆汁酸差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

图2 MAFLD组与健康对照组的胆汁酸差异性分析 A 7, 12-diketoLCA B NorDCA C TDCA D THCA

代谢物相关性往往揭示了代谢物变化的协同性，从关联热图中可见，MAFLD组与健康对照组存在显著差异的4种胆汁酸中，较健康对照组显著升高的7，12-diketoLCA与NorDCA水平呈正相关，提示两者存在协同作用；较健康对照组显著降低的TDCA、THCA水平亦呈正相关，提示两者同样存在协同作用。见图3。

图3 各种胆汁酸之间的关联热图

2.3 胆汁酸与MAFLD相关肝脏酶学指标及肝/脾CT值的相关性分析

Pearson相关性分析结果显示，在4种存在差异的胆汁酸中，仅7，12-diketoLCA水平与ALT （r＝0.549 4，P＜0.01）、GGT（r＝0.523 7，P＜0.01）水平呈正相关，见图4。4种存在差异的胆汁酸与肝/脾CT值均无相关性。

图4 胆汁酸7，12-diketoLCA水平与ALT、GGT水平的相关性分析 A 7, 12-diketoLCA水平与ALT水平呈正相关 B 7, 12-diketoLCA水平与GGT水平呈正相关

3 讨论

胆汁酸是胆汁的重要组成成分，约72种胆汁酸构成了人体胆汁酸谱。胆汁酸在肝内由胆固醇通过经典途径和替代途径转化而来：主要的经典途径起始于CYP7A1催化的一系列反应，生成初级胆汁酸CA和CDCA；替代途径由CYP27A1起始，产物为CDCA。初级胆汁酸排入小肠后经肠道细菌水解脱羟，形成次级胆汁酸DCA和LCA。这些次级胆汁酸和大部分初级胆汁酸在回肠被重吸收至门静脉血流，肝细胞摄入后分泌入胆道回到胆酸池中，由此完成了胆汁酸的肝肠循环[11]。在肝肠循环过程中，胆汁酸作为信号分子通过与各种组织不同部位的胆汁酸受体[如FXR、G蛋白偶联胆汁酸受体（GPBAR1）、G蛋白偶联受体5（TGR5）等]相结合，从而发挥调节糖、脂及能量代谢的作用[10]。

MAFLD目前已更名为“代谢相关脂肪性肝病”，此称谓强调了糖、脂代谢紊乱与该疾病的重要关系，有研究表明肥胖症患者的肠道菌群改变可提高细菌代谢产物DCA的水平，而DCA的肝肠循环可促进肝星状细胞（HSC）中能分泌不同炎性因子和促癌因子的衰老相关分泌表型（SASP），加速化学致癌物暴露诱导的小鼠肝细胞癌（HCC）的发展进程[12]。另有研究显示，MAFLD患者的肠道富含产生次级胆汁酸的细菌，通过增加底物CA的供应来增加DCA的产量，DCA增加可能会抑制肝脏和肠道中的FXR信号转导，而FXR信号通路对脂质代谢具有有益的作用[13]。胆汁酸包括亲水性胆汁酸和疏水性胆汁酸，LCA是疏水性胆汁酸，疏水性胆汁酸能破坏细胞基底膜、细胞器膜，并能特异性破坏微管膜的外层，对机体的毒性较大，其在体内聚积可损伤肝细胞和肝功能，导致胆汁淤积及ALT水平升高[14]。本研究结果显示，MAFLD组的7，12-diketoLCA和NorDCA水平均较健康对照组显著升高，相关性分析显示7，12-diketoLCA水平与ALT、GGT水平呈正相关。因7，12-diketoLCA、NorDCA分别是LCA、DCA的衍生物，故本研究结果与既往研究结果相符，表明MAFLD患者的血清胆汁酸谱确实发生了变化。此外，既往研究表明TDCA和THCA能抑制炎性反应[15-16]，而MAFLD组的这两种胆汁酸水平均较健康对照组显著降低，这可能与入组患者存在不同程度的肝细胞炎性反应有关。

综上所述，本研究结果表明，与健康人群相比，MAFLD患者的胆汁酸谱发生了变化，并且其中7，12-diketoLCA可能与MAFLD的发生相关。本研究尚存在不足之处，如样本量较小，且未对MAFLD患者进行细分，在今后的研究中将进行改进，以期为通过胆汁酸相关通路寻找治疗MAFLD的有效靶点提供依据。