结直肠癌组织中长链非编码RNA NEAT1和miR- 218-5p的表达及其与患者预后的关系

吴 哲 魏志鸿 陈少华

结直肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤，早期症状不明显，发展至晚期常有腹泻、便血、便秘、腹痛等临床表现。结直肠癌的发病与结直肠慢性炎性反应、遗传因素、高脂肪低纤维饮食、环境因素等密切相关，随着现代人生活习惯及饮食习惯的改变，结直肠癌的发病率逐年升高[1-2]。目前治疗结直肠癌的主要方式包括手术切除、放射治疗、化学治疗等，但会引起腹部疼痛、肛门失禁等不良反应，严重影响患者的预后恢复[3-4]。长链非编码RNA（lncRNA）是一类不具有编码蛋白质功能的RNA，长度约为200 bp，是表观基因组的关键调节因子，在人类恶性肿瘤中表达异常，与肿瘤的发生、发展、转移等联系密切[5-6]。近年来的研究表明，lncRNA核富集转录本1（NEAT1）在结直肠癌组织中的表达水平较高，且血清NEAT1表达水平升高与结肠癌患者的预后不良密切相关[7]，降低肿瘤组织中NEAT1的表达水平可抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭能力，并诱导肿瘤细胞凋亡[8]。miR-218-5p是miRNA家族成员，在结直肠癌组织中表达水平较低，升高miR-218-5p的表达水平可抑制结直肠癌细胞的增殖[9]，目前关于其与结直肠癌患者预后情况的关系报道较少。本文探究了结直肠癌组织中lncRNA NEAT1和miR-218-5p的表达水平与患者预后的关系，以期为临床缓解、治疗结直肠癌提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2014年7月至2015年7月在中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院肝胆外科确诊并接受治疗的95例结直肠癌患者的肿瘤组织及癌旁组织（距离肿瘤组织边缘5 cm处，经病理证实无肿瘤细胞）标本，其中男性55例，女性40例，年龄45～75岁，平均年龄为（59.77±9.24）岁。纳入标准：（1）符合《中国结直肠癌诊疗规范（2017年版）》[10]中结直肠癌的诊断标准；（2）临床资料完整；（3）为首次治疗，均行组织切除手术。排除标准：（1）接受过其他抗肿瘤治疗；（2）合并其他恶性肿瘤；（3）发生肿瘤远处器官转移；（4）合并严重的心、肾、肝等脏器功能障碍。本研究经医院医学伦理委员会批准（批件号：20140603），标本的采集均取得患者及家属的知情同意并签字。

1.2 lncRNA NEAT1和miR-218-5p表达水平的检测

采用实时荧光定量PCR（real time qPCR）法检测组织中lncRNA NEAT1和miR-218-5p的表达水平。严格按照RNA提取试剂盒（购自北京索莱宝科技有限公司）说明书的要求提取待测组织中的总RNA，使用反转录试剂盒（购自上海碧云天生物技术有限公司）合成cDNA，使用PCR仪（购自美国ABI公司）进行扩增。以U6作为内参，采用2-ΔΔCT算法计算待测组织中lncRNA NEAT1和miR-218-5p的相对表达量。PCR反应条件：95 ℃预变性90 s，之后95 ℃ 30 s、62 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s，共40个循环。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列见表1。

表1 引物序列

1.3 信息收集和随访

收集患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置、分化程度、TNM分期、浸润深度、淋巴结转移等临床资料。患者出院后，采用门诊复查、电话等方式进行随访，每3个月随访1次，为期5年，随访截至2020年7月31日或患者死亡。

1.4 统计学方法

应用SPSS 25.0软件对数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间有差异则进一步采用SNK-q检验。计数资料以例表示。采用Cox比例风险回归模型分析影响结直肠癌患者预后生存的危险因素。采用ROC曲线和Kaplan-Meier法分析lncRNA NEAT1、miR-218-5p的表达水平与结直肠癌患者生存情况的关系。lncRNA NEAT1与miR-218-5p的关系采用Pearson相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组织和癌旁组织中lncRNA NEAT1和miR-218-5p表达水平的比较

与癌旁组织比较，结直肠癌组织中lncRNA NEAT1的表达水平较高，miR-218-5p的表达水平较低，两组差异均有统计学意义（P均＜0.05）。见表2。

表2 结直肠癌组织和癌旁组织中lncRNA NEAT1和miR-218-5p的相对表达量比较

2.2 结直肠癌组织中lncRNA NEAT1和miR-218-5p的表达水平与临床指标的关系

结直肠癌组织中lncRNA NEAT1和miR-218-5p的表达水平与患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置无关（P＞0.05），而与肿瘤分化程度、TNM分期、浸润深度、淋巴结转移密切相关（P＜0.05）。详见表3。

表3 结直肠癌组织中lncRNA NEAT1和miR-218-5p的表达水平与临床指标的关系

2.3 lncRNA NEAT1与miR-218-5p的关系

经ENCORI数 据 库 预 测，miR-218-5p在lncRNA NEAT1的3'UTR存在相应的结合位点。Pearson相关性分析结果显示，lncRNA NEAT1与miR-218-5p呈负相关（r＝-0.563，P＝0.000）。详见图1、图2。

图1 lncRNA NEAT1与miR-218-5p靶向关系预测

图2 lncRNA NEAT1与miR-218-5p的相关性分析

2.4 结直肠癌组织中lncRNA NEAT1和miR-218-5p的表达与患者预后生存情况的关系

95例结直肠癌患者在为期5年的随访中有49例死亡，病死率为51.58%。以结直肠癌组织中lncRNA NEAT1相对表达量的平均数将患者分为高表达lncRNA NEAT1组（＞1.65，44例）和低表达lncRNA NEAT1组（≤1.65，51例）。高表达lncRNA NEAT1组患者的5年病死率为63.64%，显著高于低表达lncRNA NEAT1组（41.18%），组间差异有统计学意义（log-rankχ2＝6.026，P＜0.05）。以结直肠癌组织中miR-218-5p相对表达量的平均数将患者分为高表达miR-218-5p组（＞0.46，46例）和低表达miR-218-5p组（≤0.46，49例）。低表达miR-218-5p组患者的5年病死率为65.31%，显著高于高表达miR-218-5p组（36.96%），组间差异有统计学 意 义（log-rankχ2＝7.588，P＜0.05）。详 见 图3、 图4。

图3 lncRNA NEAT1在结直肠癌组织中的表达与患者生存情况的关系

图4 miR-218-5p在结直肠癌组织中的表达与患者生存情况的关系

2.5 Cox比例风险回归模型分析影响结直肠癌患者预后生存的危险因素

以结直肠癌患者预后生存情况为因变量，以淋巴结转移、TNM分期、浸润深度、分化程度、lncRNA NEAT1和miR-218-5p为自变量，纳入Cox多因素回归分析，结果显示淋巴结转移、TNM分期、浸润深度、分化程度、高表达lncRNA NEAT1、低表达miR-218-5p均为结直肠癌患者预后生存的危险因素。详见表4。

表4 影响结直肠癌患者预后生存情况的多因素Cox比例风险回归分析

3 讨论

结直肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，早期仅有消化不良、粪便潜血等症状，随着疾病进展，会出现便血、肠梗阻、腹痛、腹部包块、消瘦等症状，严重影响患者的生命安全[11-12]。随着经济的发展及人们生活水平不断提高，结直肠癌的发病率也呈逐年升高趋势。结直肠癌的发病机制复杂，筛查效果不佳，复发概率较高，预后较差，导致患者的病死率较高。因此，寻找能够准确评估结直肠癌患者预后情况的生物标志物对于降低患者的病死率具有重要意义[12]。

lncRNA几乎存在于基因表达的所有环节，以RNA的形式发挥生物学功能，其表达异常与肿瘤的发生、发展、转移等密切相关[13]。lncRNA NEAT1是lncRNA家族成员之一，Wang等[14]研究发现，lncRNA NEAT1在结直肠癌组织中的表达水平显著高于癌旁正常组织，沉默lncRNA NEAT1的表达可抑制结直肠癌细胞的侵袭能力，并提高肿瘤细胞的凋亡率。Liu等[15]研究发现，lncRNA NEAT1在结直肠癌细胞中的表达水平较高，可促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究结果显示，lncRNA NEAT1在结直肠癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织，与上述研究结果相符。此外，本研究还发现lncRNA NEAT1的表达水平与结直肠癌患者的肿瘤分化程度、TNM分期、浸润深度、淋巴结转移密切相关，且是影响患者预后生存的危险因素，这提示检测lncRNA NEAT1的表达水平有助于评估结直肠癌的严重程度及患者的预后 情况。

miRNA是一种长度约为20个核苷酸的小型非编码RNA，与结直肠癌等多种肿瘤的发生、发展联系密切，miR-218-5p是miRNA的家族成员[16]。Li等[17]研究发现，miR-218-5p在正常组织、腺瘤、结直肠癌组织中的表达水平逐渐降低。本研究结果显示，miR-218-5p在结直肠癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织，且其与肿瘤分化程度、TNM分期、浸润深度、淋巴结转移密切相关，这提示miR-218-5p可能参与了结直肠癌的发生、发展过程。此外，本研究发现低表达miR-218-5p组患者的 5年病死率显著高于高表达miR-218-5p组，表明低表达miR-218-5p是结直肠癌患者预后生存的危险因素，这提示低表达miR-218-5p不利于结直肠癌患者的预后恢复。

Zhao等[18]研究发现，乳腺癌组织中lncRNA NEAT1的表达水平较癌旁正常组织升高，lncRNA NEAT1表达水平较高的患者预后较差，且其可通过负调控miR-218促进乳腺癌细胞的侵袭和增殖。经ENCORI数据库预测，miR-218-5p在lncRNA NEAT1的3'UTR存在相应的结合位点，且本研究的Pearson相关性分析结果显示，lncRNA NEAT1与miR-218-5p呈负相关，这提示lncRNA NEAT1可能通过靶向调控miR-218-5p，参与了结直肠癌的发生和发展，但具体作用机制仍需今后深入探讨。

综上所述，结直肠癌组织中lncRNA NEAT1的表达水平较高，miR-218-5p的表达水平较低，且高表达lncRNA NEAT1及低表达miR-218-5p的患者 5年生存率较低，提示两者均与结直肠癌患者预后生存情况有关。