EGCG对高脂饮食诱发的小鼠非酒精性脂肪肝 的影响

程中华 冯 珍 唐 楠 郝颖放

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种与胰岛素抵抗及遗传易感性密切相关的代谢应激性肝损伤，其疾病谱包括非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）及相关性肝硬化和肝细胞癌（HCC）[1-2]。NAFLD不仅可导致肝脏病变甚至死亡，还与代谢综合征（MetS）、2 型糖尿病（T2DM）、动脉硬化性心血管疾病及结直肠肿瘤等的发生密切相关。随着肥胖症和MetS发病率的升高，目前NAFLD已成为中国发病率第1位的慢性肝病和健康体检肝酶异常的首要原因，并且有越来越多的慢性HBV感染患者合并NAFLD[3]。茶中含有大量多酚类化合物，它们是对健康有益的活性物质，多项临床研究均表明绿茶在促进能量消耗及脂肪氧化、降低体质量及减肥成功后的体质量维持等方面均发挥了良好的效能[4-6]。表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）作为绿茶提取物中重要和丰富的茶多酚，是茶发挥多项药理学效应的主要活性物质[7-8]。本研究探讨了EGCG对非酒精性脂肪肝模型小鼠的脂质代谢、糖代谢及肝细胞的影响，并初步分析其对脂质代谢相关基因和炎性因子相关基因表达的影响，旨在为NAFLD的防治及进一步研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

选取60只6周龄雄性C57BL/6小鼠，体质量为18～22 g，购自中科院上海实验动物中心，12 h光照及12 h黑暗交替环境，自由进食饮水，适应性喂养1周。EGCG购自美国Sigma公司。普通饲料、D12492高脂饲料（HFD）均购自中科院上海实验动物中心。TRIzol试剂盒、反转录试剂盒、实时荧光定量PCR（real-time qPCR）试剂盒均购自美国Sigma公司。qPCR引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。三酰甘油（TG）测定试剂盒购自中生北控生物科技股份有限公司，游离脂肪酸（FFA）测定试剂盒购自南京建成科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分组、造模与给药 60只小鼠适应性喂养1周后随机分为对照组、EGCG组、HFD组和HFD+EGCG组，每组15只，对照组和EGCG组均喂饲普通饲料（热量包含10%脂肪、60%蛋白质和30%碳水化合物），HFD组和HFD+EGCG组均喂饲D12492 HFD饲料（热量包含60%脂肪、20%蛋白质和20%碳水化合物）。EGCG组和HFD+EGCG组均予每2日1次灌胃EGCG（5 mg/kg）。实验期间每周2次记录所有小鼠的体质量和食物摄入量。喂养11周后处死并解剖小鼠，在心脏采血；用滤纸吸去小肠、结肠表面组织液，测量小肠、结肠长度；取出肝脏、脾脏，用滤纸吸去表面组织液，称量湿重；取肝组织标本制备肝匀浆，以供生物化学指标检测和组织病理学检查。

1.2.2 腹腔葡萄糖耐量试验 喂养10周时行腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT），小鼠于检测前6 h禁食，检测每只小鼠的体质量及基线血糖水平，向小鼠腹腔注射5%葡萄糖溶液（10 mL/kg），分别在0、15、30、60和120 min时从尾静脉采血检测血糖水平。

1.2.3 肝组织和血清中TG和FFA水平检测 取 0.2 g肝组织，剪碎后置于匀浆器中，加入2 mL冰的0.9% NaCl溶液，碾磨制成10%肝匀浆，离心后取上清液，按试剂盒说明书操作测定肝组织中TG和FFA水平。血清标本按试剂盒说明书操作测定血清 TG和FFA水平。

1.2.4 组织病理学检查 取肝左叶，用10%福尔马林固定，石蜡包裹，切片后常规H-E染色，在显微镜下观察肝组织的脂肪变性程度。每张切片随机拍摄3个视野（×200），观察肝细胞变性情况。

1.2.5 real-time qPCR法检测相关基因表达水平 使 用TRIzol试 剂（Invitrogen、Carlsbad、CA）分别从0.1 g肝组织及刮取的小鼠结肠上皮细胞中提取总mRNA，反转录后得到cDNA，采用realtime qPCR法检测游离脂肪酸受体2（FFAR2）和FFAR3的mRNA表达水平，并检测肝组织中与脂质代谢相关的脂蛋白脂肪酶（LPL）、胆固醇7α-羟化酶（CYP7A1）、脂肪酸结合蛋白1（FABP1）、长链酰基辅酶A脱氢酶（LCAD）的mRNA表达水平，以及肝脏炎性因子——趋化因子CCL2、TNF-α、IL-6、转化生长因子（TGF）的mRNA表达水平。以β-actin为内参，目的基因mRNA的表达水平以2-△△Ct表示。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3 统计学处理

应用SPSS 19.0软件对实验数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用两个独立样本的t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGCG对HFD诱发的小鼠肥胖和肝脂肪变性的影响

喂饲11周时，EGCG组与对照组的体质量差异无统计学意义（P＞0.05），而HFD组的体质量较对照组显著升高（P＜0.01），HFD+EGCG组的体质量较HFD组显著降低（P＜0.01）；各组的小肠和结肠长度差异均无统计学意义（P均＞0.05）；HFD组的脾脏和肝脏湿重均较对照组显著升高 （P均＜0.05），而HFD+EGCG组的脾脏和肝脏湿重则均较HFD组显著降低（P均＜0.05）；见表2。

表2 EGCG对HFD小鼠体质量、肝脏和脾脏湿重、小肠和结肠长度的影响

显微镜下，肝组织H-E染色结果显示，对照组和EGCG组的肝组织病理学形态表现正常，HFD组的肝组织呈重度肝细胞脂肪变性表现，肝细胞变大，细胞质内可见大泡样脂滴，而HFD+EGCG组肝细胞的细胞质内脂滴较HFD组显著减少，见图1。上述结果表明，EGCG可逆转HFD诱发的小鼠肥胖和肝脂肪变性。

图1 各组的肝组织病理图 H-E染色 ×200 A 对照组 B EGCG组 C HFD组 D HFD+EGCG组

2.2 EGCG对小鼠血糖和脂质代谢产物的影响

HFD组的肝组织和结肠组织中FFAR2和FFAR3的mRNA表达水平均较对照组显著升高（P均＜0.05）；HFD+EGCG组的肝组织和结肠组织中FFAR2和FFAR3的mRNA表达水平均较HFD组显著降低 （P均＜0.05）；见表4。

表4 4组的肝组织和结肠组织中FFAR2、FFAR3 mRNA水平的比较

喂饲10周时，IPGTT结果显示，EGCG组注射葡萄糖后15、30、60、120 min时的血糖水平与对照组的差异均无统计学意义（P均＞0.05），而HFD组的各时间点血糖水平均较对照组显著升高（P均＜0.05）；HFD+EGCG组的各时间点血糖水平均较HFD组显著降低（P均＜0.05）；见图2。EGCG组的血清和肝组织中TG和FFA水平与对照组的差异均无统计学意义（P均＞0.05），而HFD组的血清和肝组织中TG和FFA水平均较对照组显著升高（P均＜0.05，P均＜0.01）；HFD+EGCG组的血清和肝组织中TG和FFA水平均较HFD组显著降低（P均＜0.05，P均＜0.01）；见表3。realtime qPCR法检测结果显示，EGCG组的肝组织和结肠组织中FFAR2和FFAR3的mRNA表达水平与对照组的差异均无统计学意义（P均＞0.05），而

图2 各组的IPGTT结果比较

表3 4组的血清和肝组织中TG、FFA水平的比较/nmol·L-1

2.3 EGCG对小鼠肝组织中脂质代谢相关酶和炎性因子的mRNA表达水平的影响

喂饲11周时，real-time qPCR法检测结果显示，EGCG组LPL、FABP1、CYP7A1的mRNA表达水平与对照组的差异均无统计学意义（P均＞0.05），而HFD组LPL和FABP1的mRNA表达水平均较对照组显著升高（P＜0.01，P＜0.05），CYP7A1 mRNA表达水平较对照组显著降低（P＜0.05）；与HFD组相比，HFD+EGCG组LPL和FABP1的mRNA表达水平均显著降低（P均＜0.05），CYP7A1 mRNA表达水平显著升高（P＜0.01）；4组的LCADmRNA表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）；见表5。

EGCG组CCL2、TNF-α、IL-6的mRNA表达水平与对照组的差异均无统计学意义（P均＞0.05）， 而HFD组CCL2、TNF-α、IL-6的mRNA表达水平均较对照组显著升高（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05）；与HFD组 相 比，HFD+EGCG组CCL2、TNF-α、IL-6的mRNA表达水平均显著降低（P均＜0.05）；4组的TGFmRNA表达水平差异无统计学意义 （P＞0.05）；见表5。

表5 4组的肝组织中脂质代谢相关酶和炎性因子的mRNA表达水平比较

3 讨论

NAFLD的患病率在世界范围内呈上升趋势，其发病机制尚未完全明确，NAFLD发病的危险因素较多，如胰岛素抵抗、肥胖、心血管疾病、氧化应激等，长期摄入过多脂肪与NAFLD发生也有着密切关系[9-10]。从绿茶中提取的EGCG具有抗氧化、 抗炎、抗肿瘤、抗衰老等作用，近年来研究发现EGCG具有调节血脂、抗肥胖的作用，对大鼠酒精性肝损伤也有一定的保护作用[8,11]。

本研究发现，与对照组相比，HFD组小鼠的小肠和结肠长度没有明显改变，但肝脏、脾脏湿重及体质量均显著增加，肝细胞内脂滴也明显增加，而HFD+EGCG组的上述指标有明显缓解，肝脏脂肪变性也有减轻，这些结果均表明EGCG能够逆转HFD诱发的小鼠的肥胖和肝脂肪变性。此外，本研究还发现EGCG能有效改善小鼠由于HFD引起的糖耐量受损。在调节血脂方面，EGCG也可显著降低血清和肝组织中TG和FFA水平。FFAR2和FFAR3是哺乳动物肠道微生物群衍生的短链脂肪酸受体，主要在结肠上皮细胞表达，在脂肪细胞、肝细胞及免疫细胞也有表达[12]。研究发现FFAR2、FFAR3能促进肠道L细胞合成和分泌食欲因子胰高血糖素样肽-1（GLP-1）和YY肽（PYY），刺激下丘脑弓状核（ARC）内的食欲抑制神经元分泌POMC和CART，发挥抑制食欲的作用[13]。此外，FFAR2能抑制脂肪细胞中胰岛素信号通路，或作为膳食能量感受器，改善组织中葡萄糖代谢，抑制脂质合成，使机体能量状态保持稳定[14]。本研究结果表明HFD可提高小鼠结肠和肝组织中FFAR2和FFAR3的表达水平，而EGCG能降低其表达水平。综上所述，本研究结果提示，长期HFD喂饲小鼠可诱发肥胖、肝脂肪变性和高脂血症，而用EGCG干预可抑制FFAR2和FFAR3的表达，从而改善上述异常情况。

NFALD的发生与肝脏内参与脂质代谢相关酶的基因表达密切相关。LPL是脂质代谢和转运的关键酶，也是TG代谢的限速酶，LPL还可促进高密度脂蛋白和极低密度脂蛋白之间磷脂和载脂蛋白的交换[15]。可见，LPL可影响高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的水平。CYP7A1是胆固醇转化为胆汁酸过程中的限速酶，对于胆汁酸的合成和胆固醇水平的调节非常重要[16]。FABP1是FABP超家族成员，它可影响脂肪酸的摄取、运输、线粒体化和酯化，是调节肝脏脂质代谢的关键酶[17]。本研究结果发现HFD可导致小鼠肝组织中LPL和FABP1的mRNA表达水平显著升高，CYP7A1 mRNA表达水平显著降低，而用EGCG干预能逆转上述基因的表达异常。LCAD是肝细胞线粒体β氧化中催化长链脂肪酸第一步脱氢反应的关键酶，本研究显示EGCG干预前、后LCADmRNA的表达水平未发生显著变化。由于NAFLD与慢性炎性反应密切相关[18]，本研究还测量了肝组织中一些炎性细胞因子的mRNA表达水平，结果显示EGCG能有效降低高脂血症小鼠肝组织中TNF-α、CCL2和IL-6的mRNA表达水平。上述结果提示，EGCG可抑制高脂血症小鼠肝组织中LPL和FABP1的mRNA表达，促进CYP7A1 mRNA的表达，并可有效抑制肝组织中CCL2、TNF-α、IL-6等炎性因子的mRNA表达，从而提高机体对脂质的消化吸收及对TG的代谢作用，缓解小鼠肝组织的炎性反应，从而阻遏非酒精性脂肪肝的发生和发展。

综上所述，本研究结果提示HFD喂饲小鼠能诱发NAFLD，而EGCG能提高机体脂质代谢水平及抑制肝脏炎性反应，从而改善NAFLD小鼠的代谢紊乱状态。目前EGCG治疗NFALD的具体剂量、其对肠上皮紧密连接和肠道微生态的影响，以及可能的信号通路等尚未明确，这些问题将在今后的研究中进一步探讨，以期为治疗NFALD探索新的方法并提供理论依据。