基于FBXO31的慢性乙型肝炎肝纤维化无创 诊断模型的建立及评价

郑国军 刘小琴 张宏宇 刘健红

肝纤维化是慢性乙型肝炎的重要病理特征，随病程进展可发展为肝硬化，严重影响着患者的生命安全[1]。在肝纤维化早期给予积极治疗，可在一定程度上抑制病情进展，改善患者预后[2]。目前，肝穿刺活体组织检查是临床判断肝纤维化程度的“金标准”，但其作为有创性检查，会升高感染、出血等风险，患者的接受程度较低，难以广泛应用于临床[3]。无创性肝纤维化诊断方法已成为近年来的研究热点。F-box蛋白31（FBXO31）是一种细胞衰老蛋白，其过表达可抑制Hep3B细胞增殖，并使其细胞周期停滞于G1期[4-5]。研究表明，FBXO31可通过促进Samd7的泛素化调节肝星状细胞的活化和纤维化[6]，由此推测，FBXO31可反映肝纤维化程度。本研究探讨了FBXO31与慢性乙型肝炎患者肝纤维化程度的关系，并分析了基于FBXO31构建的慢性乙型肝炎肝纤维化无创诊断模型的效能。

1 资料与方法

1.1 一般资料

前瞻性选取2019年3月至2021年1月在常州市第三人民医院就诊的164例慢性乙型肝炎患者作为研究对象。慢性乙型肝炎的诊断标准参照《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》[7]。纳入标准：（1）年龄＞18岁；（2）乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阳性，持续6个月及以上；（3）接受肝穿刺活体组织检查；（4）近1年内未接受过抗纤维化或抗病毒治疗；（5）签署了知情同意书。排除标准：（1）伴有非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病、自身免疫性肝病或慢性丙型肝炎等；（2）接受过肝脏移植手术治疗；（3）伴有恶性肿瘤；（4）妊娠期患者。本研究符合《赫尔辛基宣言》，并经医院医学伦理委员会批准（批件号：2019-SR-015）。

1.2 临床信息收集及处理

收集入选患者的年龄、性别等信息。使用DxH 600血细胞分析仪[购自贝克曼库尔特实验系统（苏州）有限公司]检测血小板（PLT）水平，使用7600型全自动生化分析仪（购自日本日立公司）检测肝穿刺活体组织检查当日患者的ALT和AST水平。计算AST/PLT比值指数（APRI）和肝纤维化指数（FIB4）。公 式：APRI＝AST（/正常 值上限，IU/L）/PLT（×109/L）×100，FIB-4＝年 龄× AST（IU/L）/[PLT（×109/L）×ALT（IU/L）1/2]。

1.3 肝纤维化程度判断

在B超引导下使用16G全自动活检针经皮穿刺肝脏，取长度约10 mm的肝脏组织样本，使用10%福尔马林溶液浸泡，由病理科医师评估肝纤维化病理分期，评估标准参照《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》[7]。

1.4 FBXO31表达水平检测

所有患者于肝脏组织活体检查当日空腹抽取10 mL肘部外周静脉血，采用Ficoll密度梯度离心法提取外周血中单个核细胞[8]。采用蛋白质印迹法检测单个核细胞中FBXO31的表达水平[9]。使用RIPA裂解液裂解单个核细胞，用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白质定量；采用10%的SDS-PAGE凝胶电泳直至溴酚蓝跑出胶面，转膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h；滴加兔抗人FBXO31多克隆抗体， 4 ℃孵育过夜；滴加山羊抗兔二抗，室温下封闭1 h；采用电化学发光法（ELC）曝光显影，应用ImageJ软件读取灰度值。本实验的内参为GAPDH。本实验所用试剂均购自上海雅吉生物科技有限公司。

1.5 统计学方法

应用SPSS 26.0软件进行统计学分析。正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用F检验，组间两两比较采用SNK-q检验；非正态分布的计量资料以中位数和四分位数间距[M（QR）]表示，多组间比较采用Kruskal-WallisH检验，两两比较采用Mann-WhitneyU检验。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用Spearman秩相关分析探讨FBXO31的表达水平与肝纤维化病理分期的关系。采用logistic回归分析构建慢性乙型肝炎肝纤维化诊断模型，采用ROC曲线和决策树分析法评价该模型的效能。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 慢性乙型肝炎患者的基本资料

164例慢性乙型肝炎患者的年龄为20～66岁，平均年龄为（45.35±10.94）岁；其中男性101例，女性63例。根据肝纤维化病理分期标准，164例患者中S0期30例，S1期28例，S2期36例，S3期32例，S4期38例。ALT、AST和PLT的表达水平分 别 为122.19（128.18）IU/L、60.43（58.40）IU/L 和（128.89±28.21）×109/L。不同病理分期患者的年龄、性别差异均无统计学意义（P均＞0.05），但ALT、AST和PLT表达水平的差异有统计学意义 （P＜0.05）。具体见表1。

表1 慢性乙型肝炎患者的基本资料

2.2 不同病理分期者的FBXO31相对表达量比较

肝纤维化病理分期为S0期、S1期、S2期、S3期和S4期的患者的FBXO31相对表达量分别为0.22±0.07、0.34±0.07、0.43±0.09、0.52±0.10和0.72±0.14，多组间比较差异有统计学意义（F＝125.975，P＜0.001）。由图1可知，FBXO31的相对表达量随肝纤维化病理分期增高而升高，组间两两比较差异均有统计学意义（P均＜0.05）。Spearman秩相关分析结果显示，FBXO31的相对表达量与肝纤维化病理分期呈正相关（rs＝0.877，P＜0.001）。

图1 不同肝纤维化病理分期的FBXO31相对表达量比较

2.3 慢性乙型肝炎肝纤维化进展的模型构建及评价

采用logistic回归分析构建由FBXO31、ALT、AST和PLT组成的诊断慢性乙型肝炎肝纤维化进展的模型X（用于诊断≥S2期）、模型Y（用于诊断≥S3期）和模型Z（用于诊断S4期）。模型X的 方 程F＝-12.522+22.490×FBXO31+0.022× ALT+0.040×AST-0.001×PLT，模型Y的方程F＝ -4.643+15.391×FBXO31+0.006×ALT+ 0.018×AST-0.042×PLT，模 型Z的 方 程F＝ -10.516+15.382×FBXO31+0.002×ALT+0.013×AST-0.006×PLT。

模型X诊断慢性乙型肝炎肝纤维化病理分期为≥S2期的ROC曲线下面积（AUC）大于APRI和FIB4，差异均有统计学意义（Z＝5.778，P＜0.001；Z＝6.702，P＜0.001），见表2、图2A。模型Y诊断慢性乙型肝炎肝纤维化病理分期≥S3期的AUC大于APRI和FIB4，差异均有统计学意义（Z＝5.088，P＜0.001；Z＝6.311，P＜0.001），见 表2、图2B。模型Z诊断慢性乙型肝炎肝纤维化病理分期为S4期的AUC大于APRI和FIB4，差异均有统计学意义（Z＝3.243，P＝0.001；Z＝5.303，P＜0.001），见表2、图2C。

表2 各模型诊断慢性乙型肝炎肝纤维化进展的价值

图2 各模型诊断慢性乙型肝炎肝纤维化进展的ROC曲线 A 肝纤维化病理分期≥S2期 B 肝纤维化病理分期≥S3期 C 肝纤维化病理分期为S4期

决策树分析结果显示，模型X诊断慢性乙型肝炎肝纤维化病理分期≥S2期的净收益高于APRI和FIB4，见图3A。当风险阈值在0.00～0.75时，模型Y诊断慢性乙型肝炎肝纤维化病理分期≥S3期的净收益高于APRI和FIB4；当风险阈值在0.75～1.00时，FIB4诊断慢性乙型肝炎肝纤维化病理分期≥S3期的净收益高于APRI和模型Y，见图3B。当风险阈值在0.00～0.45时，模型Z诊断慢性乙型肝炎肝纤维化病理分期为S4期的净收益高于APRI和FIB4；当风险阈值在0.45～1.00时，FIB4诊断慢性乙型肝炎肝纤维化病理分期为S4期的净收益高于APRI和模型Z，见图3C。

图3 各模型诊断慢性乙型肝炎肝纤维化进展的决策树 A 肝纤维化病理分期≥S2期 B 肝纤维化病理分期≥S3期 C 肝纤维化病理分期为S4期

3 讨论

肝脏活体组织病理检查作为目前判断肝纤维化程度的“金标准”，虽然准确性较高，但无法进行动态评估，存在一定不足[10]。研究表明，瞬时弹性成像技术在评估肝纤维化程度方面具有较高价值[11]，但并不适用于肥胖、肋间隙较小或伴腹水的患者[12]。因此，探寻能够准确判断慢性乙型肝炎患者肝纤维化程度的指标具有重要意义。有报道指出，FBXO31可通过促进Samd7泛素化而调节肝星状细胞的活化，从而参与肝纤维化的发生和发展[6]，但目前关于FBXO31与肝纤维化程度关系的报道较少。

本研究结果显示，不同肝纤维化病理分期患者中FBXO31的相对表达量差异具有统计学意义，且随着肝纤维化病理分期增高，FBXO31的表达水平也升高。相关性分析结果也表明，FBXO31的表达水平与肝纤维化病理分期呈正相关。上述结果提示，FBXO31与肝纤维化程度有关，或可用于判断肝纤维化的病理分期。

ALT和AST是反映肝脏功能的重要指标，可被用于构建评估肝纤维化程度的模型。研究表明，肝硬化患者的PLT表达水平较低，且随着肝纤维化进展，PLT的表达水平逐渐降低[13-14]。本研究构建了由FBXO31、ALT、AST和PLT组成的诊断慢性乙型肝炎患者肝纤维化程度的模型X、模型Y和模型Z，结果显示模型X诊断慢性乙型肝炎肝纤维化病理分期≥S2期的AUC为0.978，模型Y诊断慢性乙型肝炎肝纤维化病理分期≥S3期的AUC为0.958，模型Z诊断慢性乙型肝炎肝纤维化病理分期为S4期的AUC为0.955，结果提示模型X、模型Y和模型Z对于诊断慢性乙型肝炎患者肝纤维化程度具有较高价值。

APRI和FIB4是评估肝纤维化程度常用的模型，因便于计算，且相关指标的检测费用较低，已被欧洲肝病指南认定为评估慢性丙型肝炎患者肝纤维化程度的重要参考指标[15]。有中国学者将APRI和FIB4应用于评估慢性乙型肝炎患者的肝纤维化程度，并认为该指标具有重要的临床意 义[16-17]。本研究将模型X、模型Y和模型Z分别与APRI、FIB4比较，结果显示模型X诊断慢性乙型肝炎肝纤维化病理分期≥S2期的AUC大于APRI和FIB4，决策树分析结果亦显示模型X的净收益（指诊断患者肝纤维化病理分期≥S2期的准确度）高于APRI和FIB4，这提示模型X应用于诊断慢性乙型肝炎肝纤维化病理分期≥S2期的临床价值较高；模型Y诊断慢性乙型肝炎肝纤维化病理分期≥S3期的AUC大于APRI和FIB4，但决策树分析结果显示其净收益并非一直高于APRI和FIB4，当风险阈值（指患者肝纤维化病理分期≥S3期的概率）在0.75～1.00时，FIB4的净收益高于模型Y，该结果提示单纯应用模型Y诊断慢性乙型肝炎肝纤维化病理分期≥S3期的价值有限，应根据具体情况选取合适的模型；模型Z诊断慢性乙型肝炎肝纤维化病理分期为S4期的AUC大于APRI和FIB4，但决策树分析结果显示其净收益并非一直高于APRI和FIB4，当风险阈值在0.45～1.00时，FIB4的净收益高于模型Z，该结果提示在诊断慢性乙型肝炎肝纤维化病理分期为S4期时，单纯应用模型Z存在一定不足。

综上所述，外周血单个核细胞中FBX031的表达水平随慢性乙型肝炎患者肝纤维化进展而升高。基于FBXO31构建的慢性乙型肝炎肝纤维化无创诊断模型对于诊断肝纤维化病理分期≥S2期有较高价值，但在肝纤维化病理分期≥S3期和S4期的诊断中，其净收益并非一直高于FIB4，临床价值有限，后续将纳入更多因素进行分析，以提高模型的临床应用价值。