沉默PRMT5基因对胃癌细胞株SGC-7901细胞 周期的影响及机制研究

付 波 吴雅琼 王黎黎

全球范围内的统计表明，胃癌的发病率位居恶性肿瘤的第4位，病死率位居第3位，且其发病率在中国逐年升高[1-2]。胃癌在早期以体质量降低、腹胀、烧心等亚临床症状为主，缺乏特异性，多数患者在确诊时已进入中晚期，无法进行手术治疗，仅能采取放射治疗、化学治疗等姑息性治疗方式，预后不佳[3]。随着分子遗传学、生物学及基因工程技术的不断发展，基因治疗已成为一种新的肿瘤治疗方式。蛋白质精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）是一种细胞周期调控酶，在食管癌、乳腺癌等肿瘤中表达异常，其可通过介导细胞凋亡的信号通路参与肿瘤细胞的形成[4-5]。目前关于PRMT5在胃癌中的表达及分子调控机制的研究报道较少。本研究通过开展体外细胞实验，观察沉默PRMT5基因对人胃癌细胞株SGC-7901的细胞周期、凋亡的影响，并探讨相关机制。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

正常胃黏膜细胞系GES-1和人胃癌细胞株SGC-7901均购自武汉普诺赛生命科技有限公司；PRMT5小干扰RNA（siRNA）、阴性对照载体（NC siRNA）均由上海吉玛制药技术有限公司合成；碘化丙啶（PI）染色液、AnnexinⅤ-FITC试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；兔抗人PRMT5、蛋白激酶B（AKT）、磷酸化AKT （p-AKT）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、p-mTOR一抗均购自美国Abcam公司；FACSCanto Ⅱ流式细胞仪购自美国BD公司；CheniDoc XRS+化学发光成像分析系统购自美国Bio-rad公司。

1.2 细胞培养

SGC-7901细胞在标准环境下（5% CO2、37 ℃、饱和湿度）培养于RPMI-1640培养基（含有10%胎牛血清、100 mg/L链霉素和1×105U/L青霉素）中；GES-1细胞在标准环境下培养于DMEM培养基（含有10%胎牛血清和1%双抗）中。在细胞生长至融合度≥80%时，经0.25%胰蛋白酶（含0.01% EDTA）消化、传代，取对数生长期细胞用于后续实验。

1.3 PRMT5蛋白相对表达量的检测

采用蛋白质印迹法检测细胞PRMT5蛋白的相对表达量。选取GES-1细胞和SGC-7901细胞，预冷PBS缓冲液，预冷RIPA细胞裂解液，采用BCA法定量蛋白浓度。取40 μg待测样本上样，经10% SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳后湿转至膜，室温下封闭液封闭2 h，加入稀释度为1∶500的PRMT5一抗， 4 ℃摇床孵育过夜，洗涤，加入稀释度为1∶2 000的山羊抗兔二抗，室温孵育1 h，暗室中曝光、显影、定影，使用凝胶成像系统扫描。PRMT5蛋白的相对表达量以“PRMT5蛋白条带灰度值/内参GAPDH条带灰度值”表示。

1.4 SGC-7901细胞转染和分组

在SGC-7901细胞生长至融合度≥90%时弃去培养液，用胰蛋白酶消化，取对数生长期细胞接种至6孔板，每孔2 mL，细胞密度为1×105个/mL， 培养过夜。将SGC-7901细胞分为control组、NC组、PRMT5 siRNA组和PRMT5 siRNA+胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）组，其中control组不进行处理，NC组按照LipofectamineTM3000脂质体法转染说明书转染NC siRNA，PRMT5 siRNA组转染PRMT5 siRNA，PRMT5 siRNA+IGF-Ⅰ组 转 染PRMT5 siRNA并加入IGF-Ⅰ使其终浓度为10 ng/mL。 转染48 h后，采用蛋白质印迹法检测各组细胞PRMT5蛋白的相对表达量。

1.5 细胞周期的检测

采用PI染色法检测细胞周期。在各组细胞生长至融合度≥80%时，使用0.25%胰蛋白酶消化，终止培养，将细胞转移至15 mL离心管中，以 2 000 r/min在4 ℃下离心5 min；PBS液冲洗，继续离心5 min；100 μL PBS液重悬，加入1 mL预冷的70%乙醇，混合均匀；4 ℃固定12 h，离心，PBS液冲洗；加入染液（含有25 μL的PI染液、10 μL 的RNaseA和0.5 mL的染色缓冲液），避光冰浴 30 min；使用300目细胞滤网过滤，用流式细胞仪检测细胞周期。所有操作重复3次，取均值。

1.6 AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率

选取各组细胞，转染48 h后，用binding buffer液充分洗涤，离心后弃上清液，用binding buffer液重悬，与5 μL的AnnexinⅤ-FITC混匀，4 ℃遮光孵育20 min，加入5 μL的PI染液并混匀，遮光孵育30 min；之后，在60 min内使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。所有操作重复3次，取均值。

1.7 AKT、p-AKT、mTOR和p-mTOR蛋白相对表达量的检测

采用蛋白质印迹法检测各组细胞AKT、p-AKT、mTOR和p-mTOR蛋白的相对表达量。选取各组细胞，操作步骤同1.3小节，目的蛋白的相对表达量以“目的蛋白条带灰度值/内参GAPDH条带灰度值”表示。

1.8 统计学方法

应用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用LSD-t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种细胞中PRMT5蛋白的相对表达量比较

蛋白质印迹法检测结果表明，SGC-7901细胞中PRMT5蛋白的相对表达量为0.86±0.09，显著高于GES-1细胞（0.42±0.06），两组差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图 1 蛋白质印迹法检测两种细胞中PRMT5蛋白的表达水平

2.2 SGC-7901细胞各组中PRMT5蛋白的相对表达量比较

蛋白质印迹法检测结果表明，control组、NC组、PRMT5 siRNA组和PRMT5 siRNA+IGF-Ⅰ组中PRMT5蛋白的相对表达量分别为0.85±0.08、0.87±0.09、0.21±0.03和0.50±0.06。与control组、NC组比较，PRMT5 siRNA组中PRMT5蛋白的相对表达量均较低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）； 与PRMT5 siRNA组比较，PRMT5 siRNA+IGF-Ⅰ组中PRMT5蛋白的相对表达量较高，差异有统计学意义（P＜0.05）。control组与NC组中PRMT5蛋白的相对表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

图 2 蛋白质印迹法检测各组中PRMT5蛋白的表达水平

2.3 各组细胞周期情况的比较

流式细胞仪检测结果表明，与control组、NC组比较，PRMT5 siRNA组中G0/G1期细胞的占比较高，而S期、G2/M期细胞的占比较低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）；与PRMT5 siRNA组比较，PRMT5 siRNA+IGF-Ⅰ组中G0/G1期细胞的占比较低，而S期、G2/M期细胞的占比较高，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。control组与NC组中 G0/G1期、S期、G2/M期细胞的占比差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表1。

表1 各组细胞周期情况的比较/%

2.4 各组细胞凋亡率的比较

AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测的结果表 明，control组、NC组、PRMT5 siRNA组 和PRMT5 siRNA+IGF-Ⅰ组的细胞凋亡率分别为（1.57±0.32）%、（1.60±0.31）%、（35.74±4.96）%和（15.24±2.07）%。与control组、NC组 比 较，PRMT5 siRNA组的细胞凋亡率均较高，差异均有统计学意义（P均＜0.05）；与PRMT5 siRNA组比较，PRMT5 siRNA+IGF-Ⅰ组的细胞凋亡率较低，差异有统计学意义（P＜0.05）。control组与NC组的细胞凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

图3 流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率 A control组 B NC组 C PRMT5 siRNA组 D PRMT5 siRNA+IGF-Ⅰ组

2.5 各组细胞p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR的比较

与control组、NC组 比 较，PRMT5 siRNA组细胞p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR均较低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）；与PRMT5 siRNA组比较，PRMT5 siRNA+IGF-Ⅰ组细胞p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR较高，差异有统计学意义（P＜0.05）。control组与NC组细胞p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR 的差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2、图4。

图 4 蛋白质印迹法检测各组AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR蛋白的表达水平

表 2 各组细胞p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR的比较

3 讨论

胃癌是由多种致病因素综合作用的结果，幽门螺杆菌感染、胃息肉史、不良饮食习惯、遗传等均为胃癌发病的危险因素[6-7]。目前手术治疗、放射治疗和化学治疗是胃癌的主要治疗方式，可在一定程度上延长患者的生存时间，但上述治疗方式在中晚期患者的治疗中效果并不理想。研究表明，已发现有140余种基因表达异常或基因产物变异参与了胃癌的发展进程[8-9]。本研究结果显示，与正常胃黏膜细胞系GES-1比较，人胃癌细胞株SGC-7901中PRMT5蛋白的表达水平升高，这提示PRMT5基因异常高表达于胃癌细胞中，沉默该基因可能会为胃癌的治疗提供新的思路。

PRMT5定位于哺乳动物的细胞核及细胞质中，其不仅是重要的表观遗传酶，而且是介导实体肿瘤发展进程的促癌基因，可通过调控转录后表达、RNA加工、可变剪切诱导甲基化组蛋白、非组蛋白底物精氨酸残基发生甲基化，调控多条信号通路及靶基因，参与细胞增殖、分化、凋亡及肿瘤形成等过程。研究表明，PRMT5异常高表达于非小细胞肺癌、结直肠癌、膀胱癌等多种实体瘤中，且其表达水平与肿瘤TNM分期、分化程度、远处转移及淋巴结转移、预后等密切相关[10-12]。Liu等[13]在研究胃癌的发病机制时发现，癌基因c-Myc可与PRMT5直接相互作用，促进胃癌细胞的生长，这提示PRMT5具有促进胃癌进展的作用。本研究结果显示，与control组比较，PRMT5 siRNA组中G0/G1期细胞的占比、细胞凋亡率较高，而S期、 G2/M期细胞的占比较低，这提示沉默PRMT5基因可将细胞阻滞于G0/G1期，并促进其凋亡。

PI3K是酪氨酸激酶下游重要的信号元件，可通过激活细胞膜上的第二信使诱导下游AKT、mTOR表达。PI3K介导的信号通路异常激活在肿瘤的形成过程中起着重要作用，可引发AKT依赖性或不依赖性信号转导，调控肿瘤细胞的增殖、分化、迁移、凋亡等过程[14]。Xu等[15]研究发现，PI3K/AKT信号通路是促进胃癌进展的主要通路之一，使用该通路抑制剂可抑制胃癌细胞增殖，其可能是治疗胃癌的潜在靶标。蛋白质磷酸化是指由蛋白质激酶催化，将ATP的磷酸基转移至底物蛋白质氨基酸残基上的过程，在细胞信号转导的过程中起着重要作用，也是调控蛋白质功能的重要机制。部分蛋白质可通过磷酸化发挥生物调节作用，磷酸化蛋白/总蛋白表示总蛋白被激活的程度。本研究结果显示，转染PRMT5 siRNA可降低SGC-7901细胞的p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR；在转染PRMT5 siRNA后，再添加PI3K/AKT信号通路激活剂IGF-Ⅰ，可减弱PRMT5 siRNA对SGC-7901细胞周期的阻滞作用及细胞凋亡的促进作用，这提示PRMT5可能通过抑制PI3K/AKT信号通路参与胃癌细胞周期及凋亡的调控。

综上所述，沉默PRMT5基因可阻滞人胃癌细胞株SGC-7901的细胞周期，并促进其凋亡，推测其作用机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路有关。本研究存在一定不足，如未进行体内试验，未能阐明PRMT5基因在机体内的作用机制；此外，PRMT5基因可能通过多条信号通路参与胃癌的调控，需在今后的研究中持续探索，以便为临床提供更多的治疗靶点。