褪黑素通过内质网应激促胃癌细胞凋亡作用机制

李为民，胡成琛，吴 蓉，沈惠琳，李国栋，李国熊

(1.杭州师范大学附属医院 消化内科，浙江 杭州 310015；2.杭州市丁桥医院 消化内科，浙江 杭州 310021)

0 前言

胃癌(gastric cancer, GC)作为全球第五大常见恶性肿瘤，其致死率在癌症中高达第三位。尽管在过去的几十年里，人们越来越关注胃癌的筛查和治疗，但大多数患者的生存率仍低于5年，术后生活质量仍得不到改善，且常见的化疗药物还存在不完善、非特异性及副作用大等缺点。因此，我们迫切需要寻找新型、有前途的胃癌治疗药物，并分析其生物学机制。

内质网(endoplasmic reticulum, ER)是真核细胞中重要的细胞器，它参与真核细胞内蛋白质的合成、折叠及运输过程。当内质网受到外界干扰，导致稳态被破坏，如酸中毒、缺氧和营养物质缺乏，从而改变内质网容量与蛋白质折叠负荷之间的不平衡，并在内质网中积累未折叠蛋白，这种状态称为内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)。当内质网应激开始时，未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)的激活可通过细胞调控内质网应激，恢复内质网的稳态。在长期持续的压力作用条件下，ERS和UPR可使细胞直接进入凋亡途径。越来越多的研究表明，ERS及由其引发的UPR与肿瘤的发生发展有着密切的联系。

褪黑素(melatonin，MLT)作为一种吲哚类物质，由松果体、视网膜、大脑、心脏和胃肠道系统合成。据报道，褪黑素在胃肠道分泌量是松果体的400多倍。早年研究发现褪黑素作为一种抗氧化酶，可以清除氧自由基，保护氧化损伤。随着对褪黑素认识加深，褪黑素还可抑制多种人类癌症的增殖，包括白血病、乳腺癌、结直肠癌、肺腺癌及胃癌。然而，关于胃癌中内质网应激反应与褪黑素抗癌作用之间的分子机制研究罕有报道。因此，我们拟进一步探究褪黑素与内质网应激的相关性，以期为胃癌的新治疗靶点的研究提供更多科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人胃癌AGS细胞株购自上海中科院细胞库。

1.1.2 主要试剂 F12K培养基、胎牛血清、0.25%胰酶/EDTA、褪黑素(MLT)和4-苯基丁酸(4-PB)均购自美国Sigma公司，CCK-8细胞增殖分析试剂盒购自日本株式会社同仁化学研究所，Annexin V FITC/PI凋亡试剂盒购自浙江杭州联科生物技术股份有限公司，GRP78和Cleaved-caspase-3购自美国CST公司，ATF6和TRAF-2购自杭州华安生物技术有限公司，-actin抗体购自英国Abcam公司。

1.2 细胞培养 使用含10%胎牛血清F12K培养基培养AGS细胞，置于37℃、5%CO恒温培养箱中培养。根据细胞的生长情况、培养基消化情况进行换液，平均2～3天换液一次。若细胞生长到80%时需进行传代培养。判断细胞活力使用台盼蓝染色。

1.3 细胞处理和形态学观察 MLT和4-PB均使用二甲基亚砜(DMSO)溶解。细胞处理先弃去细胞废液，PBS清洗2遍，再将含有MLT或4-PB的培养基加入细胞，用于干预研究。本研究团队既往研究已证实MLT作用AGS存在时间依赖性，48 h干预细胞表型变化明显，故本研究时间节点选择48 h。取不同浓度褪黑素作用AGS胃癌细胞48 h，通过倒置显微镜观察细胞形态，并拍照分析形态差异。

1.4 实验分组 ①正常对照组：对AGS细胞只使用含血清F12K培养基培养；②褪黑素组：加入MLT，使在培养基中浓度为2 mmol/L；③4-PB组：加入内质网应激抑制剂4-PB，使在培养基中浓度为200 μmol/L；④褪黑素+4-PB组：先加入4-PB常氧条件下培养24 h，再加入褪黑素进行干预。

1.5 细胞增殖检测 取对数生长期的人胃癌AGS细胞，用0.25%胰酶消化并收集细胞。以F12K完全培养液制成细胞悬液，按4×10个/mL接种于96孔培养板中(每孔100 μL)，细胞培养过夜后，分别给予不同浓度MLT(1～4 mmol/L)和4-PB(浓度200 μmol/L)干预。细胞干预48 h后，弃去废液，用PBS轻轻清洗2次后，每孔加入含有10 μL CCK-8的培养基100 μL，在37℃、5% CO及相对湿度95%条件下，继续孵育2 h，经振荡器振荡混匀后采用酶标仪(波长450 nm)，按照下列公式计算肿瘤细胞增殖抑制率。肿瘤细胞增殖抑制率=(各加药孔吸光度均值-空白孔吸光度均值)/(对照组吸光度均值-空白孔吸光度均值)×100%。通过SPSS计算药物IC50值，分析比对后选择2 mmol/L作为后续实验浓度。

1.6 细胞集落试验检测 经MLT和4-PB处理AGS细胞，继续培养5～8天(每2～3天更换新鲜培养液)。实验结束后，用PBS轻轻清洗2次，4%多聚甲醛固定15～20 min、再PBS轻轻清洗2次，结晶紫染色(1mL/孔，染色15～20 min)，最后再PBS小心冲洗残余染液，晾干，相机拍摄记录各组细胞形成集落数量。

1.7 细胞凋亡检测 取生长状态良好的细胞，以4×10/孔接种于6孔板中，培养48 h后通过MLT和4-PB干预，于48 h时间点收集细胞，弃去培养基，PBS洗2次，每孔加入1 mL胰酶消化，提取单细胞悬液。按3×10个细胞加入1.5 mL Ep管中，PBS轻洗1遍，1 000 rpm离心5 min后，加1×Binding Buffer 缓冲液500 μL重悬细胞，后各管中加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混匀，室温避光15 min后，使用流式细胞仪上机测定。最后采用波长488 nm，分别以红色和绿色荧光通道检测细胞凋亡，并用FlowJo软件分析。

1.8 Western blot检测蛋白表达 经MLT和4-PB处理AGS细胞48 h，PBS清洗2次后收集细胞。首先加入RIPA细胞裂解液，冰浴30 min，低温高速离心，吸取上层澄清液转移到1.5 mL离心管中，置于冰上待用。采用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定各样本蛋白浓度，并将各组蛋白稀释到等量浓度，置于沸水浴5 min使蛋白变性。各组样本蛋白按35 μg上样到10%聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)，恒压电泳100 min，恒流60 min转膜至聚偏二氟乙烯(PVDF)，5%脱脂牛奶封闭1 h，TBST缓冲液洗膜3次(每次5 min)，加入一抗4℃震荡过夜。次日取膜用TBST洗膜3次(每次10 min)，加入二抗室温孵育l h，TBST洗膜3次(每次10 min)。最后取ECL发光液A和B，1∶1混匀滴在膜上，避光下用Bio-Rad凝胶成像系统扫描并进行数据分析。根据数据分析不同组间GRP78、ATF6、TRAF-2内质网应激相关蛋白和活化状态凋亡蛋白Caspase-3变化情况。

2 结果

2.1 细胞形态的变化 倒置显微镜下，观察各组细胞状态变化。胃癌细胞株AGS在单纯胎牛血清培养基中形态呈梭形、核圆、大小均一、分布密集。而在褪黑素浓度1 mmol/L和2 mmol/L作用下，细胞形态变圆、分布扩散、间隙增大、细胞碎片增多及细胞量减少，见图1。

倒置显微镜白光观察细胞形态(×100)，A.单纯含血清培养基培养；B.1 mmol/L MLT培养；C.2 mmol/L MLT培养图1 褪黑素作用细胞形态变化Figure 1 Effect of melatonin on cell morphology

2.2 细胞增殖抑制率变化 CCK-8测定不同褪黑素浓度和内质网应激抑制剂4-PB作用细胞48 h后细胞增殖能力变化。如图2所示，褪黑素作用细胞以剂量依赖的方式抑制细胞增殖，IC50值是2.82 mmol/L。4-PB联合褪黑素作用细胞后增殖率为68.24%，较2 mmol/L褪黑素抑制率63.20%有所上升，差异有统计学意义(<0.01)。

与对照组比较，*P<0.01，**P<0.05；下同。图2 褪黑素及4-PB对细胞增殖影响Figure 2 Effect of melatonin and 4-PB on cell proliferation

2.3 细胞克隆变化 比较褪黑素和4-PB对AGS细胞克隆影响，由图3可知，2 mmol/L褪黑素明显抑制细胞克隆形成，4-PB作用可缓解褪黑素对AGS细胞抑制作用。

A.正常组，B.2 mmol/L MLT组，C.4-PB组，D.2 mmol/L MLT+4-PB组图3 褪黑素及4-PB对细胞克隆的影响Figure 3 Effect of melatonin and 4-PB on cell monoclonal formation

2.4 细胞发生凋亡变化 Annexin V-FITC/PI检测褪黑素对细胞凋亡的作用。结果显示，使用2 mmol/L褪黑激素处理AGS细胞，细胞早期凋亡率和晚期凋亡率为14.1%和13.2%。加入4-PB干扰褪黑素促凋亡作用，早期凋亡率和晚期凋亡率为8.5%和3.8%，见图4D。

A.正常组，B.2 mmol/L MLT组，C.4-PB组，D.2 mmol/L MLT+4-PB组图4 褪黑素及4-PB对细胞凋亡的影响Figure 4 Effect of melatonin and 4-PB on cell apoptosis

2.5 褪黑素对胃癌细胞凋亡作用调控机制 Western blot法检测药物作用48 h后细胞蛋白变化。与对照组相比，褪黑素组处理后促进ERS相关蛋白GRP78、ATF6和TRAF-2增加，同时上调Cleaved-caspase-3表达(图5A)。加入内质网应激抑制剂4-PB干扰褪黑素，蛋白GRP78、ATF6、TRAF-2表达均下调，且Cleaved-caspase-3表达也下降，与褪黑素组相比存在统计学差异(<0.05，图5B)。

图5 褪黑素对AGS细胞ERS及凋亡蛋白的影响Figure 5 Effects of melatonin on ERS and apoptosis proteins of AGS cells

3 讨论

胃癌是中国第二大常见肿瘤，在癌症相关死亡率中排名第二。我们早期研究发现，褪黑素作为一种吲哚胺，可协助顺铂发挥抗胃癌作用。在不同的病理生理条件下，不同浓度褪黑激素对各种人恶性肿瘤具有抑制作用。本研究旨在探讨褪黑激素对人胃癌细胞抗肿瘤作用可能涉及的信号通路，为开发新的抗肿瘤药物奠定基础。

细胞凋亡作为抗癌作用关键机制，一直备受关注。目前，死亡受体信号途径、线粒体途径以及内质网应激(ERS)是细胞凋亡的三大途径。其中，ERS途径是一种新的细胞凋亡途径。越来越多研究表现内质网应激与癌细胞的凋亡和自噬密切相关。我们研究认为内质网应激参与了褪黑激素诱导的人胃癌细胞凋亡。因此，需要更多的研究去证实内质网应激和凋亡之间的相互干扰作用，才能够阐明褪黑激素发挥抗癌机制。

在本研究中，与对照组相比，经褪黑素处理的AGS细胞中凋亡细胞百分比明显上升，同时褪黑激素能够抑制细胞增殖和克隆能力。本研究结果基本证实了褪黑素在体外抑制癌细胞的生长，对胃癌具有潜在的抗癌作用。在基本的分子机制中，褪黑激素可促进GRP78蛋白上调，作为ERS核心调节因子，其激活促进内质网应激信号通路ATF6和TRAF-2表达增加，从而证实褪黑素可影响胃癌细胞内质网应激发生。4-PB是一种低分子游离脂肪酸，可以稳定蛋白质合成，抑制内质网应激，恢复细胞内环境稳态。为了进一步验证ERS在褪黑素诱导AGS细胞凋亡中的作用，我们采用4-PB预处理细胞。通过4-PB抑制的内质网压力相关蛋白作用，使得褪黑素抗癌作用明显下降，包括抑制细胞增殖、克隆及凋亡。观察4-PB联合褪黑素作用AGS细胞后GRP78、TRAF-2、ATF6蛋白表达均下降，且促凋亡蛋白Caspase-3也受到抑制。GRP78作为一个至关重要的ER分子伴侣，在ER应激下,GRP78释放IRE1α和ATF6蛋白，发挥UPR作用。当IRE1α释放后可招募TRAF-2，激活细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)，进一步促进细胞凋亡和自噬。ATF6活化可间接下调抗凋亡蛋白Mcl-1，并促进成肌细胞发生凋亡。本研究认为褪黑素持续作用癌细胞，通过上调GRP78分子，诱导ERS发生，上调TRAF-2和ATF6的表达，并进一步导致细胞凋亡。

本研究的不足在于未从动物和临床研究角度验证褪黑素可通过内质网应激信号通路对胃癌作用，仅在体外细胞株上验证其抗癌疗效。基于褪黑素在临床上已普遍用于促睡眠治疗，今后笔者将设计褪黑素用于治疗胃癌患者的临床试验，这将为褪黑素在胃癌治疗中提供可靠的实验依据。

综上所述，本研究揭示了褪黑素可促进ERS反应，并验证ERS参与褪黑素促细胞凋亡作用。结合褪黑素对胃癌作用，其可能是抗肿瘤治疗的一个强有力的候选药物。但整个诱导细胞凋亡过程中，还有其他多个信号通路的参与，褪黑素促进胃癌AGS细胞凋亡机制还可进一步探讨。