miR-204对小鼠心肌缺血再灌注损伤后的作用机制研究

朱为民，沈 秀，徐宇啸

(浙江省台州医院/台州恩泽医疗中心(集团)恩泽医院 1.急诊科； 2.急诊外科；3.病理科，浙江 台州 318000)

心肌急性缺血发生后，应对组织灌注进行及时恢复治疗，但再灌注本身能进一步加剧心肌损伤的受损程度，即引发心肌缺血再灌注(I/R)损伤。相关文献报道微小RNA(miRNA)作为一类约20个核苷酸的非编码RNA，其在肿瘤、神经系统、免疫及心血管等疾病中均存在一定的调控作用。既往报道miR-204参与了癌症、眼科及高血压等疾病的发生发展，而miR-204对I/R损伤机制的研究在国内尚未报道。通过生物信息学网站预测，2是miR-204其中的一个靶基因，有研究发现2可通过JAK-STAT通路对IGF-1的表达产生抑制作用，进而加剧糖尿病I/R损伤。鉴于此，本研究拟在建立I/R损伤模型基础上，探讨miR-204是否通过抑制SOCS2表达对小鼠I/R损伤作用机制产生影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物 50只C57BL/6小鼠购自南京君科生物工程有限公司，每只体质量20～30 g，10～12 周龄。自由进食饮水，适应喂养1 w，饲养环境：清洁级，湿度维持在55%～60%，室温22℃～25℃，正常昼夜节律。先选用10只小鼠，构建心肌缺血再灌注模型并进行鉴定，之后随机选择30只小鼠按鉴定成功的建模方法进行后续实验。本实验经本院动物伦理协会批准审核，受到动物伦理协会的监督。

1.2 I/R小鼠模型构建建模前，10只小鼠禁食8 h，采用1%戊巴比妥钠溶液麻醉小鼠；取仰卧位，消毒后切开小鼠颈前区皮肤，分离组织、肌肉，充分暴露气管；气管插管，连接呼吸机；在小鼠第5肋间隙表皮左侧做纵向切口，约2 cm，接着逐层对胸大、小肌进行分离，刺穿暴露的第四肋间隙，向左侧穿破纵膈，将心脏挤出。在左心耳下缘 0.5 cm处，通过 6-0 缝合线对左冠状动脉进行结扎。建模成功的判断标准：当缺血时局部心肌组织苍白，心电图监测提示ST段抬高，则表明结扎成功；半小时后，将活结松开且重新计时，若5 min内ST 段恢复或与之前波形存在明显区别，则再灌注成功。之后将心脏置于胸腔，排气胸，缝合皮肤。假手术组(Sham，10只)采用同样的开胸方式，但不结扎左冠状动脉。

1.3 实验动物分组与处理 余30只小鼠分为I/R组、mimics-NC组、miR-204 mimics组，每组10只。mimics-NC组、miR-204 mimics组小鼠在建模前48 h将100 uL mimics-NC、miR-204 mimics预先与Lipofectamine 2000混合分别注射至小鼠心肌内。实验结束后进行后续指标检测。

1.4 主要试剂 戊巴比妥钠溶液购自Sigma公司；Lipofectamine 2000及RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司；mimics-NC及miR-204 mimics均购自上海吉玛制药技术有限公司，ELISA试剂盒购自贝克曼库尔特公司；Masson染色试剂盒购自Service Biological Technology公司；PrimeScript RT试剂盒及SYBRPremix Ex TaqⅡ试剂盒购自宝生物工程有限公司；ABI PRISM7300系统购自美国ABI 公司；BCA试剂盒购自AmyJet Scientific公司；SOCS2一抗购自Cell Signaling Technology公司，二抗购自Abcam公司；质粒提取试剂盒购自Promega公司；荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司。引物序列：miR-204，上游：5’ GCCAGATCTGGAAGAAGATGTGGTGGGTTAGT 3’，下游：5’ GGCGAATTCACAGTTGCCTACAGTATTCA 3’；U6，上游5’CTCGCTTCGGCAGCACATATACT3’，下游5’ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC3’；SOCS2 ，上游：5’ AGCAGTTTGACAGCGTGGTT 3’，下游：5’ CAGGTAAAGGTGAACAGTCCC 3’；β-actin ，上游：5’ CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC3’，下游：5’ TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT3’。

1.5 实验室检测

1.5.1 血清因子 取小鼠腹主动脉血5 mL，3 000 r/min离心，取上清，参照ELISA试剂盒(贝克曼库尔特公司，加州，美国)说明书操作步骤测定脑钠肽(BNP)、心肌肌钙蛋白( CTn-I)、肿瘤坏死因子(TNF-a)、白细胞介素-1β( IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)，采用日立全自动生化分析仪检测乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)。对比各组心肌损伤因子(BNP、cTnI、CK-MB及LDH)及炎症因子(TNF-a、IL-1β、IL-6)水平。

1.5.2 心肌组织形态学观察 实验结束后,采用颈椎脱臼法处死小鼠,立即取出心脏，冲洗残血至心室腔无血液流出，对去除心室及心房的心脏组织进行冲洗，一部分心肌组织在4%多聚甲醛溶液中固定，一部分组织保存于-80℃。

取置于4%多聚甲醛中固定24 h后的心脏组织，截取心肌组织，做0.3 cm厚的切片，将左室分为6片。常规石蜡包埋切片,做6 μm厚的薄片，置于45℃恒温箱中烘干。苏木精染色3 min，于1%的盐酸乙醇中2 s，1%氨水返蓝，伊红染色3 min，脱水至透明，中性树脂封片，干燥72 h，于光学显微镜下对心肌组织形态学进行观察。

取置于4%多聚甲醛中的心肌组织，常规切片，脱蜡。在不同酒精梯度中进行浸泡，Masson染色，观察心肌组织纤维化程度，光镜下观察，每张切片选取5个视野进行观察拍照。

1.5.3 miR-204、2 mRNA测定 通过qRT-PCR检测各组小鼠心肌组织中miR-204、2 mRNA的表达，通过RNA提取试剂盒提取心肌组织中总RNA。通过PrimeScript RT试剂盒将RNA逆转录为cDNA，逆转录体系10 μL。通过SYBRPremix Ex TaqⅡ试剂盒及ABI PRISM7300系统进行荧光定量PCR。反应条件：95℃ 10 min(95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s)循环40次。数据予以2法计算目的基因的表达。其中U6是miR-204的扩增内参，β-actin是2 、TNF-a、IL-1β、IL-6的扩增内参。

1.5.4 SOCS2 蛋白测定 采用Western blot实验测定心肌组织中SOCS2 蛋白表达水平。取心肌组织，经RIPA裂解液裂解，研磨后离心取上清，通过BCA试剂盒测定蛋白浓度。将提取的总蛋白与上样缓冲液混合，经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法分离蛋白，转到硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，滴加一抗(1∶1 000) 4 ℃孵育过夜，室温下磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，加入相应的羊抗兔二抗(1∶2 000)37℃孵育l h，洗涤，化学发光试剂显影，蛋白印记图像用ImageJ2x软件分析。

1.5.5 荧光素酶活性检测 采用生物信息学软件http://starbase.sysu.edu.cn/预测miR-204和2的靶向关系。合成含miR-204结合位点的2 3’UTR启动子区序列，构建2 3’UTR野生型(WT)质粒(2-WT)。并在该质粒基础上，突变结合位点，按质粒提取试剂盒方法构建2 3’UTR 突变型(MUT)质粒(2-MUT)。将2-WT、2-MUT质粒分别和mimics NC、miR-204 mimics质粒混匀后共转染于HEK293细胞。转染48 h后，使用荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性。

2 结果

2.1 小鼠心肌组织中miR-204、SOCS2表达情况 各组小鼠的miR-204、SOCS2表达水平比较，差异具有统计学意义(<0.05)，见表1及图1。所有I/R小鼠的miR-204表达均低于Sham组，而2 mRNA及其蛋白表达高于Sham组，差异有统计学意义(<0.05)。I/R组与mimics-NC组之间miR-204、2表达情况差异无统计学意义(>0.05)，miR-204 mimics组的miR-204表达高于mimics-NC组，2 mRNA及蛋白表达低于mimics-NC组，差异有统计学意义(<0.05)。

图1 各组心肌组织中SOCS2蛋白的表达Figure 1 SOCS2 protein expression in myocardial tissues of each group

表1 各组小鼠心肌组织中miR-204、SOCS2 表达的比较Table 1 Comparison of miR-204 and SOCS2 expression in myocardial tissue of mice in each group

2.2 各组小鼠血清中心肌损伤标志物的比较 各组心肌损伤因子(BNP、cTnI、CK-MB及LDH)的表达情况比较，差异具有统计学意义(<0.05)，见表2。所有I/R小鼠的心肌损伤因子表达水平均高于Sham组， mimics-NC组的心肌损伤因子水平均高于miR-204 mimics组，差异均有统计学意义(<0.05)；I/R组与mimics-NC组的心肌损伤因子水平比较无显著性差异(>0.05)。

表2 各组小鼠血清中心肌损伤标志物的比较Table 2 Comparison of myocardial injury markers in serum of each group of

2.3 各组小鼠心肌组织病理学形态的比较 HE染色结果显示：Sham组心肌组织染色均匀，心肌纤维排列整齐，心肌细胞结构正常，无病理变化；I/R组、mimics-NC组心肌纤维排列紊乱，正常的心肌结构遭到破坏，梗死病灶存在大量炎性细胞的浸润，心肌细胞较为肿胀，且存在瘢痕组织；miR-204 mimics组心肌纤维结构的受损及炎性细胞的浸润程度有所减轻，见图2。

Masson染色结果显示：Sham组心肌组织纤维排列整齐，着色均匀，未存在胶原成分；I/R组、mimics-NC组蓝色区域增多，说明胶原成分增加，心肌纤维化程度明显，且心肌细胞明显减少；miR-204 mimics组心肌纤维化程度减轻，见图2。

图2 各组小鼠心肌组织镜下观(HE×200，Masson×200)Figure 2 Microscopic view of myocardial tissue of mice in each group (HE×200, Masson×200)

2.4 各组小鼠血清中炎症因子的比较 各组的炎症因子(TNF-a、IL-1β、IL-6)表达水平比较，差异具有统计学意义(<0.05)，见表3。所有I/R小鼠的炎症因子表达水平高于Sham组，mimics-NC组的炎症因子表达水平高于miR-204 mimics组，差异均有统计学意义(<0.05)；I/R组与mimics-NC组的炎症因子水平差异无统计学意义(>0.05)。

表3 各组小鼠血清中炎症因子的比较Table 3 Comparison of serum inflammatory factors in each group of mice pg/mL)

2.5 miR-204与SOCS2的关系 通过Targetscan预测网站发现miR-204可以结合SOCS2，见图3a。荧光素酶活性实验结果显示：SOCS2-WT和miR-204 mimics共转染HEK293细胞后，细胞的相对荧光素酶活性降低，差异有统计学意义(<0.05)；而SOCS2-MUT和miR-204 mimics共转染后，细胞的相对荧光素酶活性无明显变化(>0.05)，见图3b。

a. Targetscan网站预测miR-204与SOCS2的靶向关系；b.双荧光素酶验证miR-204与SOCS2的靶向关系。图3 Targetscan网站预测miR-204与SOCS2的靶向关系Figure 3 Prediction of targeting relationship between miR-204 and SOCS2 by Targetscan website

3 讨论

miRNA属于一类长度约为21 nt的RNA，可通过调控靶基因在机体的病理反应过程中发挥重要作用。其中有研究报道miR-204多与癌症相关疾病的发生发展密切相关，发现miR-204在癌组织中常呈低表达水平，而在癌旁组织中呈高表达水平，对癌细胞的侵袭迁移具有抑制作用，并促进癌细胞的凋亡。还有研究认为miR-204对心血管疾病的发生也具有一定的调控作用，Yu等研究发现沉默lncRNA AK139328可显著增加miR-204-3p的表达，抑制心肌细胞自噬，对糖尿病型I/R具有缓解作用。

SOCS家族是一类新型的小分子量多肽，近年来研究报道SOCS与心血管疾病发生密切相关。2属于SOCS家族中的一员，其可作为调控糖尿病I/R损伤的关键基因，且可通过 JAK-STAT 通路沉默IGF-1的表达进而加重糖尿病I/R损伤。然而近些年来关于miR-204调控2参与I/R的作用机制研究尚未见报道。鉴于此，本实验探究了上调miR-204表达水平对小鼠心肌组织中SOCS2的表达情况，结果显示，miR-204在I/R模型小鼠中呈低表达，在健康小鼠中呈高表达，而2与其表达趋势恰好相反，且上调I/R小鼠中miR-204的表达可显著抑制其SOCS2的表达水平。提示miR-204可能通过抑制SOCS2的表达对小鼠I/R的病理机制发挥作用。具体作用原因有待进一步研究。此外，本研究还发现，所有I/R小鼠的BNP、cTnI、CK-MB及LDH水平均显著高于Sham组；miR-204 mimics组BNP、cTnI、CK-MB及LDH水平均显著低于mimics-NC组。这一结果说明上调miR-204的表达可有效降低心肌损伤标志物BNP、cTnI、CK-MB及LDH水平，对I/R小鼠心肌组织损伤的恢复具有促进意义。分析原因可能与上调miR-204表达对SOCS2的表达具有抑制作用有关，因为SOCS2的高表达对I/R病情的加重具有调控作用。

心肌组织病理学异常及心肌纤维化程度加剧均为I/R损伤常见的病理特征，本研究发现，I/R小鼠心肌组织结构遭到严重破坏，病灶区出现大量炎性细胞的浸润，心肌细胞肿大，且心肌纤维化明显，而miR-204 mimics组小鼠上述病理状态较阴性对照组明显减轻。提示上调miR-204的表达对减轻I/R小鼠心肌组织病理损伤及心肌纤维化具有促进意义。研究报道，炎症反应在I/R发病进展中发挥着重要作用，其中促炎因子，如TNF-a、IL-1β、IL-6，已成为心肌功能异常的关键损害因子。促炎因子的释放将对心肌组织出现大量炎性细胞因子的浸润具有促进作用，还能造成毛细血管阻塞及细胞毒性物质的合成，最终引发急性组织损伤。本研究结果显示，I/R小鼠的TNF-a、IL-1β、IL-6水平均显著高于Sham组；I/R组与mimics-NC组之间的炎症因子水平无显著性差异，miR-204 mimics组炎症因子水平均显著低于mimics-NC组。提示，miR-204的高表达可有效降低血清中炎症因子水平，降低炎性反应。分析原因可能是因为miR-204对2具有负调控作用，而有研究报道2可通过抑制JAK/STAT通路来降低TNF-a、IL-6等炎症因子水平。为了进一步证实miR-204与2之间的作用关系，本研究通过生物信息网站预测二者之间存在结合位点，且采用双荧光素酶报告实验证明了2是miR-204的靶基因。进一步说明，miR-204对I/R病理机制的调控是通过靶向抑制2表达来发挥作用的。

综上所述，上调miR-204的表达，能减轻小鼠I/R病理学状态，改善心肌损伤指标水平，降低炎症反应，其作用原因可能与抑制2的表达有关。