三种金黄色葡萄球菌选择性分离培养基的检测效果比较

顾其芳 张红芝 朱颖莹 鲁珺琰 於颖 刘诚 刘玥 陈敏

摘要：【目的】比较三种金黄色葡萄球菌选择性分离培养基的检测效果。【方法】分别使用Baird-Parker培养基（BP）、兔血浆纤维蛋白原培养基（RPF）和科玛嘉葡萄球菌显色培养基（CHROMagarTMStaph aureus）对标准菌株、食品分离株以及食品样品进行对比检测。【结果】三种选择性培养基对金黄色葡萄球菌的回收率均达到95%以上；RPF和CHROMagarTMStaph aureus培养基的检测效率明显高于BP培养基；且两种培养基敏感性、特异性均优于传统的BP培养基。【结论】应用RPF和CHROMagarTMStaph aureus培养基检测食品中金黄色葡萄球菌，较传统的BP培养基具有更好的检测效果，建议将RPF和CHROMagarTMStaph aureus培养基作为可靠的分离检测培养基应用于食品中金黄色葡萄球菌的分离检测。

关键词：金黄色葡萄球菌；Baird-Parker培养基；兔血浆纤维蛋白原培养基（RPF）；科玛嘉葡萄球菌显色培养基；检测效果

中图分类号：R195 文献标志码：A DOI：10.19428/j.cnki.sjpm.2018.18378

引用格式：顾其芳，张红芝，朱颖莹，等.三种金黄色葡萄球菌选择性分离培养基的检测效果比较[J].上海预防医学，2018，30（1）：69-73.

Detection effects compared between three types of selective media for Staphylococcus aureus GU Qi-fang，ZHANG Hong-zhi，ZHU Ying-ying，LU Jun-yan，YU Ying，LIU Cheng，LIU Yue，CHEN Min（Shanghai Municipal Center for Disease Control and Prevention，Shanghai 200336，China）

Abstract： [Objective] To compare the detection effects between three kinds of selective media for Staphylococcus aureus. [Methods] Baird-Parker （BP） agar，Rabbit Plasma Fibrinogen （RPF） agar and CHROMagarTMStaph aureus were selected to test the standard strains，food-isolated strains as well as food samples. [Results] More than 95% recovery efficiency could be reached by utilization of all the three types of media. However，the detection effects of RPF and CHROMagarTMStaph aureus were significantly higher than that of BP agar.Moreover，their sensitivity and specificity were also superior to that of conditional BP agar. [Conclusion] Better detection effect is obtained from RPF and CHROMagarTMStaph aureus when compared to that from BP agar，suggesting that RPF and CHROMagarTMStaph aureus agar are more reliable for the detection of Staphylococcus aureus in food.

Keywords：Staphylococcus aureus；Baird-Parker agar；Rabbit Plasma Fibrinogen agar（RPF）；CHROMagarTMStaph aureus；detection effect

金黃色葡萄球菌是引起人类食源性疾病的重要病原菌之一，对其的微生物检测方法目前仍以常规分离培养为主。GB 4789.10—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》规定Baird-Parker培养基（BP）为唯一使用的选择性培养基[1]。它也是目前国内实验室最多采用的分离培养基，但此培养基不能检测出对卵黄反应阴性的金黄色葡萄球菌，其特异性不高。因此需要补充包括革兰氏染色、镜检、凝固酶等试验才能确认[2]。而在国外，一种利用凝固酶阳性的葡萄球菌可将兔血浆纤维蛋白原培养基（RPF）中的纤维蛋白原分解为不溶性蛋白，使菌落外围出现沉淀晕环，直接可以对凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌进行分离确认的技术被广泛使用[3-5]。另外，20世纪90年代后期开发应用的显色培养基技术通过观察菌落颜色对菌株进行分离鉴定，也是对传统检测手段的一个突破[6-7]。由于金黄色葡萄球菌是重要的食源性致病菌，而培养基的选择又是检验工作的关键，因此本研究采用标准菌株、食品分离株及各类食品样品，比较BP、RPF及CHROMagarTMStaph aureus三种培养基对金黄色葡萄球菌分离培养的检测效果进行初步评价。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 标准菌株： 金黄色葡萄球菌ATCC6538及金黄色葡萄球菌ATCC25923；实验室保存菌株：食品中分离的金黄色葡萄球菌菌株40 株，非金黄色葡萄球菌菌株50株。以上菌株均由上海市疾病预防控制中心菌种室提供。

1.1.2 培养基和试剂 RPF培养基（货号：44003）、冻干兔血浆（货号：55181）由法国生物梅里埃公司提供；CHROMagarTMStaph aureus培养基（货号：CP60015 ）由郑州人福博赛生物技术有限责任公司提供；BP培养基（货号：CMD023）、胰胨大豆（TSA）培养基（货号：CMD027）、血琼脂培养基（货号：CMD002）、7.5%氯化钠肉汤（货号：CMA058）、牛肉汤（货号：CMA001）由上海市疾病预防控制中心提供。

1.1.3 样品来源 2017年1月—4月在上海市食品超市、农贸市场采集的调理肉制品、熟肉制品、生牛奶等食品共计243份，经冷链送达实验室。

1.2 方法

1.2.1 选择性培养基目标菌株回收率、检测效率测试 回收率是选择性培养基分离效果的重要指标。本研究根据GB 4789.10—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》对于目标菌回收率测定要求，选用金黄色葡萄球菌ATCC6538、ATCC25923菌株，经血琼脂培养基纯培养后挑取单个菌落转种（36±1）℃牛肉汤增菌过夜，将此增菌液用无菌生理盐水调成0.5麦氏浓度菌悬液，并10倍梯度稀释至10-8，选择10-5、10-6、10-7稀释度的菌悬液，每个稀释度分别吸取1 mL样品混匀液以0.3、0.3、0.4 mL接种量分别加入3块BP、RPF、CHROMagarTMStaph aureus、TSA培养基[8]，然后用无菌涂布棒涂布整个培养基，于36℃培养48 h后计数。各种选择性琼脂与TSA培养基的菌落数的比值，即为选择性培养基的回收率。同时观察菌株在18 h、24 h、48 h生长情况并记录。各培养基预期的典型菌落形态： RPF培养基呈黑色、灰色或白色，外围有沉淀晕环的菌落；CHROMagarTMStaph aureus培养基呈紫红色至粉红色菌落；BP培养基呈灰黑色至黑色，周围绕以不透明圈（沉淀）菌落。

1.2.2 选择性培养基敏感性、特异性测试 选取上海市疾病预防控制中心菌种室提供的金黄色葡萄球菌食品分离株40株、非金黄色葡萄球菌菌株50株，经血琼脂培养基纯培养后挑取单个菌落转种（36±1）℃牛肉汤增菌过夜，用无菌生理盐水调整测试菌液浓度0.5 MCF，取0.01 mL菌液分别加入至RPF培养基、BP培养基和CHROMagarTMStaph aureus培养基，用接种环划线接种，置（36±1）℃培养，观察培养基单个菌落生长情况。各培养基上出现符合典型金黄色葡萄球菌菌落生长的菌株数与已经鉴定是金黄色葡萄球菌菌株数的比值即为选择性培养基的敏感性；各培养基上出现不符合典型金黄色葡萄球菌菌落生长的菌株数与已经鉴定是非金黄色葡萄球菌菌落数的比值为选择性培养基的特异性。

1.2.4 食品样品检测方法 样品增菌方法参照GB 4789.10—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》规定的方法，增菌后分别划线接种RPF和CHROMagarTMStaph aureus培养基置（36±1）℃培养24 h，BP培养基置（36±1）℃培养48 h，挑取可疑菌落进行鉴定。

1.2.5 菌株鉴定 通过挑取不同的选择性培养基上的可疑菌落进行染色镜检、溶血试验和血浆凝固酶试验，符合金黄色葡萄球菌特征，以此确认为金黄色葡萄球菌检出阳性。

2 结果

2.1 选择性培养基目标菌株的回收率

金黄色葡萄球菌ATCC6538、ATCC25923菌株在BP 、RPF、CHROMagarTMStaph aureus培养基回收率：ATCC6538分别为98.5%、96.9%、100.0%；ATCC25923分别为96.6%、101.4%、100.7%。见表1。三种选择性培养基的回收率差异無统计学意义（P>0.05）。

2.2 选择性培养基目标菌株的检测效率

2株金黄色葡萄球菌标准菌株在三种不同选择性培养基上生长情况分别为：在BP培养基上培养18～24 h时，菌落较小，黑色，无晕圈，生长没有呈现典型菌落特征或者特征表现不明显，培养至48 h后菌落呈现典型生长形态，黑色，有晕圈；在RPF培养基上培养18 h后，菌落黑色、稍有沉淀环，培养24 h后呈现典型性状；在 CHROMagarTMStaph aureus培养基上培养18 h时菌落呈粉红色至紫红色，24 h后菌落均呈紫红色。可以看出，CHROMagarTMStaph aureus培养基和RPF培养基对目标菌株检测效率优于BP培养基，菌落呈现典型特征的速度快、生长好，两种培养基检测所需时间比使用BP培养基缩短24 h左右（表2）。又因RPF培养基里含有兔血浆，所以，在RPF培养基上生长的典型金黄色葡萄球菌不需再做血浆凝固酶就可确认，缩短菌株鉴定时间6 h左右。

2.3 选择性培养基的敏感性、特异性

在BP、RPF、CHROMagarTMStaph aureus三种选择性培养基上反映40株金黄色葡萄球菌相应的典型菌落生长（敏感性）分别为90.0%（36/40）、95.0%（38/40）和97.5%（39/40）；50株非金黄色葡萄球菌的非典型菌落（特异性）分别为92.0%（46/50）、100.0%（50/50）和96.0%（48/50）。其中BP培养基有2株表皮葡萄球菌、1株溶血葡萄球菌、1株沃氏葡萄球菌出现假阳性菌落，CHROMagarTMStaph aureus培养基上有1株无乳链球菌、1株藤黄微球菌生长出假阳性菌落。RPF培养基未出现假阳性菌落，测试结果表明CHROMagarTMStaph aureus培养基对金黄色葡萄球菌的敏感性最高，RPF培养基的特异性最高。见表3。

2.4 食品样品检测

2017年1月—4月在上海市食品超市、农贸市场采集销售的调理肉制品、熟肉制品、生牛奶等食品共计243份，按照GB 4789.10—2016标准增菌后，分别划线接种于BP、RPF、CHROMagarTMStaph aureus培养基，共有25件样品检出金黄色葡萄球菌，总检出率为10.3%（25/243）。其中BP、RPF、CHROMagarTMStaph aureus培养基对目标菌的检出率分别为8.2%（20/243）、9.5%（23/243）和9.9%（24/243）；敏感性分别为80%（20/25）、92%（23/25）和96%（24/25）；特异性分别为94.0%（205/218）、98.6%（215/218）和96.3%（210/218） 。实验结果表明，CHROMagarTMStaph aureus培养基对样品中金黄色葡萄球菌的检出率最高；RPF培养基假阳性率最低；BP培养基的检测敏感性、特异性较其他2种培养基差。见表4 。

3 讨论

在选择性增菌后使用分离培养基进行目标菌的分离鉴定是目前金黄色葡萄球菌检验的关键步骤之一。由于不同的分离培养基应用的原理不一样，检测方法的适用性、检测人员技术差异等因素，对各种分离培养基做好实验室质量控制和应用评估非常重要。

本次实验显示，3种选择性培养基的回收率都达到95%以上。表明3种选择性培养基性能相当，方法可靠。从检测效率方面看，RPF、CHROMagarTMStaph aureus培养基在实验中呈现典型菌落的时间短、生长好，检测所需时间比使用BP培养基缩短24 h左右，RPF培养基更可缩短菌株鉴定时间6 h左右；RPF、CHROMagarTMStaph aureus培养基的检测效率明显高于BP培养基。另外，使用CHROMagarTMStaph aureus培养基对检测人员要求不高，只要通过简单的观察菌落形态、颜色，就可进行检测。而传统的BP培养基观察判断结果时对检测人员经验（目标菌辨别能力）要求较高，所以显色培养基操作简单，能克服因人员的差异造成实验的假阴性现象。

分离培养基对目标菌的敏感性反映了方法可能存在的假阴性情况，3种培养基在对实验室分离株测试的敏感性均达到90%以上，但在对实际樣品测试时，3种培养基敏感性都有不同程度的下降，BP培养基尤为明显（80%）。这可能和食品成分复杂、培养基杂菌生长多、抑制目标菌生长有关；BP培养基的抑菌性能相对更差，非目标菌株，如变形杆菌、芽胞杆菌的生长都会影响目标菌的检出[7，9]。这个观点从BP培养基对食品中金黄色葡萄球菌的检出率为8.2%，比RPF（9.5%）、CHROMagarTMStaph aureus（9.9%）要低的实验结果中得到验证。

分离培养基对目标菌的特异性直接反映方法假阳性情况。实验表明，BP培养基上有2株表皮葡萄球菌、1株溶血葡萄球菌、1株沃氏葡萄球菌出现假阳性菌落，CHROMagarTMStaph aureus培养基有1株无乳链球菌、1株藤黄微球菌生长出假阳性菌落，RPF培养基在此次实验中未出现假阳性菌落。但有报道称RPF培养基检测金黄色葡萄球菌的假阳性率为1%，主要来自中间葡萄球菌[5，10]。

此次实验显示，RPF、CHROMagarTMStaph aureus培养基在测试菌株敏感性和特异性方面均优于BP培养基，但是没有一种选择型培养基的敏感性、特异性达到100%，在实验过程中仅仅采用单一的选择性培养基，不可避免会有漏检的风险。因此，采用多种选择性培养基是避免漏检现象发生的可行而有效的方法。建议将RPF、CHROMagarTMStaph aureus培养基作为一种可靠的检测技术应用于食品中金黄色葡萄球菌的分离检测。

参考文献

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