QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定6 种典型农药及3 种代谢物在黄瓜中的残留消解动态

张鸿超, 陈德勇, 韩 莹, 陈捷胤,戴小枫, 孔志强*,, 颜廷才

(1. 沈阳农业大学 食品学院，沈阳 110866；2. 中国农业科学院 植物保护研究所，北京 100193；3. 塔里木大学 生命科学学院，新疆维吾尔自治区 阿拉尔 843300)

黄瓜种植过程易发生病虫害，目前主要通过化学农药进行防治，但由于连续大量使用化学农药，使得病虫害的抗药性增加，农药使用量进一步加大，且因黄瓜果实成熟期短和安全间隔期不足，导致黄瓜中农药残留甚至超标风险升高[1-2]。

目前，国内登记用于黄瓜病虫害防治的药剂多达几百种，但在黄瓜种植过程中仍然存在使用未登记农药的现象，如以调节植物生长的多效唑、防治黄瓜红蜘蛛的丁氟螨酯以及防治黄瓜赤霉病的丙硫菌唑为代表的农药残留处于监管盲区，导致其使用存在安全隐患。此外，喷施到植物上的农药母体有10%～20% 转化为其代谢产物[3]，这些代谢物表现出的迁移性、持久性及毒性等各不相同[4]。如丁氟螨酯在环境中会转化成复杂的代谢产物，主要代谢产物中B-3 对哺乳动物毒性大，难降解，对环境和人类都有潜在的风险[5]。

目前，关于黄瓜中农药检测方法主要有液相色谱 (LC)[6]、高效液相色谱-串联质谱 (HPLCMS/MS)[7-8]、气相色谱 (GC)[9]、气相色谱-串联质谱 (GC-MS/MS)[10]等，但同时检测黄瓜中多效唑、戊唑醇、丙硫菌唑等6 种农药及3 种代谢物(丁氟螨酯代谢物B-3、三唑酮代谢物三唑醇、苯醚甲环唑代谢物CGA205375) 残留的分析方法尚未见报道，且目前已有的结果大多是在单次直接施用农药后进行试验获得的，而在实际设施农业生产过程中，农药常为多次频繁使用，不断累积造成了农药的 “持久” 残留[11]。因此，本研究选择设施蔬菜-黄瓜中常用的6 种农药，参照其在设施蔬菜生产过程中的施药剂量与残留水平，设置了推荐剂量和极端施药剂量 (5 倍推荐剂量) 两种剂量，通过QuEChERS 前处理方法，采用UPLCMS/MS 法测定其在黄瓜中的消解动态及代谢规律，以期为其在黄瓜上的科学施用提供理论依据并指导实际生产。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Waters ACQUITY UPLC 液相色谱仪， Xevo TQ-S micro Triple Quadrupole Mass Spectrometry 质谱仪和MassLynx 工作软件，ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱 (美国Waters 公司)；十万分之一天平 (瑞士Mettler Toledo 公司)；涡旋混匀器(Scientific Industries 公司)；Centrifuge 5424 高速冷冻离心机 (德国 eppendorf 公司)；VX-Ⅲ 多管涡旋振荡器 (北京安简科技有限公司)；EVAPTM111 氮吹仪 (美国OA 公司)；Cleanert MAS-Q 2 mL Centrifuge Tube 固相萃取填料 (天津博纳艾杰尔公司)。

标准品：丙硫菌唑 (prothioconazole)、丁氟螨酯代谢物B-3[(2-(trifluoromethyl) benzamide)]、丁氟螨酯 (cyflumetofen)、苯醚甲环唑 (difenoconazole)、三唑酮 (triadimefon)、戊唑醇 (tebuconazole)、多效唑 (paclobutrazol)、苯醚甲环唑代谢物CGA205375(difenoconazole-alcohol)、三唑酮代谢物三唑醇 (triadimenol)，质量浓度均为1000 μg/mL，购于天津阿尔塔科技有限公司。田间试验药剂信息见表1。乙腈 (色谱级，99.0%)， 购自Macklin 公司 (中国)，甲酸 (色谱级) ，购自赛默飞世尔科技 (中国) 有限公司；氯化钠、无水硫酸镁和L-半胱氨酸盐酸盐由国药化学试剂有限公司 (中国上海) 提供。

表1 6 种田间试验药剂信息Table 1 Commercial information of 6 pesticides

1.2 田间试验与取样

田间试验根据《农作物中农药残留试验准则》[12]于2020 年5 月在北京市海淀区上庄镇赵前旗蔬菜大棚进行，共划分为3 个试验小区，分别设5 倍推荐剂量和推荐剂量及空白对照组，每个小区面积为16 m2，小区间设1 m 宽的保护行。于黄瓜植株挂果期施药1 次，采取喷雾方式分别施用推荐剂量和5 倍推荐剂量的混合农药，分别于施药后2 h 及1、3、5、7、10、14、21 d，采收成熟健康可食用果实，于 −20 ℃下保存，待测。

1.3 样品前处理

称取10 g (精确至0.1 g) 均质后的黄瓜样品于50 mL 聚乙烯离心管中，加入1.0 g 的L-半胱氨酸盐酸盐与10.0 mL 乙腈提取，高速涡旋振荡匀浆5.0 min 后，加入6 g 硫酸镁与1.5 g 氯化钠，高速涡旋振荡1.0 min 后，于4000 r/min 下离心5.0 min；准确吸取1.5 mL 上清液，加入装有Cleanert MASQ 2mL Centrifuge Tube (150 mg MgSO4，50 mg PSA，15 mg GCB) 固相萃取填料的试管中，高速涡旋振荡30 s，于8000 r/min 下离心5.0 min；取上清液，过0.22 μm 有机滤膜，供UPLC-MS/MS分析。

1.4 标准溶液配制

混合标准储备液 (用作添加回收、校准和对照溶液)：9 种目标化合物标准品溶液 (1000 μg/mL)各取1 mL 置于10 mL 容量瓶中，用乙腈稀释并定容至刻度，配成100 μg/mL 的农药混合标准储备液，于 −20 ℃保存，备用。

混合标准工作溶液 (用于绘制溶剂标准曲线)：用乙腈稀释上述混合标准储备液，配制成质量浓度在0.001～0.8 μg/mL 之间的系列混合标准工作溶液，现配现用。

基质匹配混合标准工作溶液 (用于绘制基质匹配标准曲线和计算添加回收率)：取空白黄瓜样品，按1.3 节中前处理方法制得空白基质溶液，用空白基质溶液稀释上述混合标准工作溶液，配制成0.001～0.8 μg/mL 的基质匹配混合标准工作溶液。

1.5 仪器检测条件

色谱条件：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm × 50 mm, 1.7 μm)；柱温40 ℃；样品室温度4 ℃；流动相及梯度洗脱条件见表2，流动相A 相为体积分数0.1%的甲酸水，B 相为乙腈；进样量5 μL；流速0.5 mL/min。

表2 流动相及洗脱梯度Table 2 Mobile phase and elution gradient

质谱条件：电喷雾离子源正离子扫描 (ESI+)；多反应监测模式。毛细管电压2.20 kV；离子源温度150 ℃；脱溶剂气温度500 ℃；锥孔气流量150 L/h；脱溶剂气流量1000 L/h；碰撞气体压力270 kPa。详细质谱离子参数见表3。

表3 6 种农药及3 种代谢物质谱参数Table 3 Mass spectrometry parameters of 6 pesticides and their 3 metabolites

1.6 数据处理

参照文献[13]，利用SigmaPlot version 12.0(Systat Software Inc. Point Richmond，CA) 一级动力学方程拟合农药在黄瓜中的消解趋势。

基质效应的存在会影响方法的准确性和灵敏度。评价净化剂的净化效果时，应考虑分析方法的基质效应 (Me)，基质效应的计算公式见式 (1)。

式中，km为基质匹配标准曲线的斜率，ks为溶剂标准曲线的斜率。当Me在80%～120%之间时，基质效应可以忽略；当Me>120%时为基质增强效应；当Me<80%时为基质减弱效应[14]。

1.7 添加回收试验

称取10.0 g (精确至0.1 g) 空白黄瓜样品于离心管中，分别添加0.001、0.01、0.05、0.1 和0.5 mg/kg 的农药混合标准溶液，每个水平重复5 次，按1.4 节及1.5 节的方法进行前处理及测定，计算平均回收率及相对标准偏差 (RSD)。

2 结果与讨论

2.1 方法验证

根据《农作物中农药残留试验准则》[12]要求，通过线性、回收率、相对标准偏差、检出限(LOD) 和定量限 (LOQ) 等参数验证方法是否满足农药残留分析的要求。结果表明：按1.5 节的条件测定，该方法实现了黄瓜基质中9 种分析物较好的分离，无干扰峰 (图1)。在0.001～0.8 μg/mL 之间，9 种分析物的线性方程决定系数 (R2)均大于0.99，表明该方程线性关系良好。以10 倍信噪比对应的添加水平作为定量限 (LOQ)，则9 种分析物的LOQ 在0.001～0.01 mg/kg 之间 (表4)。

表4 9 种分析物在黄瓜中的线性方程、决定系数、回收率、基质效应及定量限Table 4 Linear equation, R2, recovery, matrix effect and LOQ of 9 analytes in cucumber

续表4Table 4 (Continued)

图1 9 种分析物总离子色谱图Fig. 1 Total ion chromatograms of 9 analytes

Me在87.00%～102.55%之间，表明不存在明显的基质效应[14]。故本研究采用溶剂标准曲线或黄瓜基质匹配标准曲线进行定量分析均可。

9 种分析物在黄瓜中的平均回收率在71%～105%之间，RSD 在1.7%～8.8%之间，小于20%，可满足农药残留检测要求[12]。

2.2 6 种农药在黄瓜中的消解动态

本研究中农药残留量是指使用农药后，残存在黄瓜果实中的农药母体或代谢物的量。除丙硫菌唑外，其余5 种农药 (多效唑、三唑酮、戊唑醇、苯醚甲环唑、丁氟螨酯) 在黄瓜中的消解动态均符合一级反应动力学方程。按照表1 推荐剂量和5 倍推荐剂量施用，2 h 后黄瓜样品中5 种农药的残留量分别为0.0064～0.021、0.73～3.7、0.49～2.1、2.7～12 及0.12～0.68 mg/kg，5 种农药在黄瓜中的残留量均与施药时间成指数关系，可用一级反应动力学方程进行拟合，其消解动态曲线见图2。由表5 可知，5 种农药在黄瓜中的半衰期在3.15～9.62 d 之间，均属于易降解农药 (< 30 d)。多效唑在黄瓜中的半衰期为4.31～7.15 d，其5 倍推荐剂量下的半衰期与推荐剂量下的相差最大，延长2.84 d，施药后 5～7 d 消解率达到85%，21 d后未检出，与杨锐[15]关于多效唑在番茄中的残留研究结果相吻合。三唑酮在黄瓜中的半衰期为3.15～5.21 d，施药后7～10 d 消解率为 95%，与前人[16-17]的研究结果相吻合。戊唑醇在黄瓜中的半衰期为3.35～4.62 d，施药后7～10 d 消解率为 95%，与李洪等[18]的研究结果一致。苯醚甲环唑在黄瓜中的半衰期为4.29～4.66 d，5～7 d 消解率为 90%，施药后 21 d 未检出，与周松等[16]关于其在草莓果实中半衰期4.09 d 的结果相符。丁氟螨酯在黄瓜中的半衰期为6.90～9.62 d，10～14 d 消解率为80%，21 d 后未检出，与李敏敏等[19]关于丁氟螨酯在土壤中的半衰期大于10 d 相比，存在一定的差距，这可能是因为丁氟螨酯的消解与有氧和厌氧环境、光解作用的影响有关。从总体数据看，在极端施药 (5 倍推荐剂量) 条件下，除丙硫菌唑外，其余5 种农药的半衰期都比推荐剂量下有不同程度延长。农药的降解与农药性质、初始浓度、环境pH 值、温湿度、作物栽培条件及作物生长状况等因素有关，在不同条件下，半衰期有不同程度的变化。吴祥为[20]的研究表明，农药的半衰期与其使用剂量和施药频次相关，高剂量施用会明显抑制农药的降解并导致半衰期延长。三唑酮、戊唑醇、苯醚甲环唑均属于内吸性三唑类杀菌剂，其挥发性、极性、空气-水分配系数、辛醇-水分配系数各不相同。丙硫菌唑按推荐剂量施药后残留量低于LOQ，在5 倍推荐剂量下，2 h 的残留量为0.053 mg/kg，1 d 后低于LOQ，这可能是因为丙硫菌唑的消解速率非常快，极容易被氧化，更容易受环境因素的影响[20-21]。

表5 5 种农药在黄瓜中的消解动力学方程、半衰期及决定系数Table 5 Dissipation kinetic equation, dissipation rate constant, half-life,and determination coefficient of 5 pesticides in cucumber

图2 5 种农药在黄瓜中的消解动态Fig. 2 Dissipation dynamics of 5 pesticides in cucumber

2.3 代谢物消解动态

图3 为丁氟螨酯、苯醚甲环唑、三唑酮3 种母体对应代谢物的消解动态。推荐剂量下，丁氟螨酯代谢物B-3 在施药后5 d 达到最大值 (0.0047 mg/kg) ；5 倍推荐剂量下，施药后3 d 达到最大值(0.0081 mg/kg)，21 d 时依然能检测到B-3 残留，与Wang 等[21]的研究结果趋势一致，说明丁氟螨酯代谢物性质较稳定，在不同生态环境条件下残留差异不明显。由于B-3 的毒性大于母体化合物[21]，残留时间比母体化合物长，因此在农产品农药残留检测分析中其代谢物的残留分析不容忽视。与B-3 的趋势相同，在推荐剂量下，三唑酮代谢物三唑醇在施药后5 d 达到最大值 (0.044 mg/kg)；5 倍推荐剂量下，在施药后3 d 达到最大值 (0.12 mg/kg)，但在14 d 后没有检测到其残留，可能是因为三唑酮的原始沉积量相对较少，与兰腾芳等[22]关于三唑酮在小麦和土壤中消解动态的研究结果相似。苯醚甲环唑代谢物CGA205375 在推荐剂量下于施药后3 d 达到最大值 (0.034 mg/kg)；5 倍推荐剂量下同样在施药后3 d 达到最大值(0.051 mg/kg)，在10 d 后未检测到其残留。CGA205375 在黄瓜中消解速率较快，可能是因为植物细胞自身代谢较强和在大气中易光解所致。

图3 B-3，CGA205375 和三唑醇在黄瓜中的残留消解动态Fig. 3 Residual dissipation dynamics of B-3, CGA205375 and triadi menol in cucumber

3 结论

本研究采用UPLC-MS/MS 技术，通过田间试验对黄瓜中6 种常用农药 (多效唑、戊唑醇、丙硫菌唑、苯醚甲环唑、丁氟螨酯、三唑酮) 的消解动态进行了研究。结果表明，除丙硫菌唑外，其余5 种农药在黄瓜中的消解动态均符合一级反应动力学方程，在极端施药 (5 倍推荐剂量)条件下，5 种农药的半衰期均有不同程度延长。本研究同时针对CGA205375、B-3 和三唑醇3 种代谢物的残留动态进行了研究。研究结果可为设施蔬菜的日常监控及风险评估等提供数据支撑。