苯醚甲环唑农药残留检测技术的研究进展

洪霞，钱滢文，冯玉升，王懂帅，何海宁，汪永松，高志莹，张彦军，*

（1.甘肃省商业科技研究所有限公司，甘肃兰州730010；2.甘肃中商食品质量检验检测有限公司，甘肃兰州730010）

苯醚甲环唑（difenoconazole）又名噁醚唑，化学名称为顺，反-3-氯-4-[4-甲基-2-（1H-1，2，4-三唑-1-基甲基）-1，3-二噁戊烷-2-基]苯基4-氯苯基醚，分子式 为 C19H17Cl2N3O3， 分 子 量 为 406.27，CAS号 为119446-68-3，其化学结构式如图1所示。

图1 苯醚甲环唑结构式Fig.1 The molecular structure of difenoconazole

苯醚甲环唑于1989年研发成功上市，销售0.45亿美元，2003年进入亿美元产品之列，2013年销售3.1亿多美元。1999年我国第一次登记了10%苯醚甲环唑水分散粒剂产品，此后国内厂家竞相开发，截至2015年，已登记含苯醚甲环唑的产品有540个，销售3千多万美元，是一种较好的杀菌剂品种[1]。苯醚甲环唑属三唑类杀菌剂，是甾醇脱甲基化抑制剂，具有高效、广谱、低毒、用量低的特点，其内吸性极强，通过抑制麦角甾醇（构成细胞膜的重要成分，对细胞膜的渗透性起重要作用）的生物合成，破坏细胞膜结构功能，从而达到杀菌目的，对蔬菜和瓜果的纹枯病、锈病、早疫病、叶斑病、黑星病、白粉病等具有很好的保护和治疗作用，具有持效期长，与其他杀菌剂无交互抗性，不污染农产品，不杀伤天敌的优点[2-3]。

由于常规化学杀菌剂的长期使用及滥用，造成绝大多数病害对其产生抗性，致使其对靶标病害的防效大幅下降，只有大剂量使用时才有效，加大防治成本。基于苯醚甲环唑用量低、亩使用成本小、有持效期长等的优点，使得苯醚甲环唑大量使用，用来提高农作物的产量和品质。在查阅文献的基础上，对苯醚甲环唑的毒性、前处理方法和分析技术进行总结，为今后分析检测各类样品基质中苯醚甲环唑农药残留提供参考和依据。

1 苯醚甲环唑的毒性

由于苯醚甲环唑直接喷施在水果和蔬菜上，其留于蔬菜中通过食用进入人体，累积后可能会危害人体健康，对此，王筱芬等[4]对苯醚甲环唑毒性及致突变性进行了试验研究，结果表明，雌性大鼠急性经口LD502 000 mg/kg，雄性大鼠为1 710 mg/kg，对兔皮肤和眼睛有刺激作用，对小鼠生殖细胞和体细胞无明显旳遗传损伤，对豚鼠无皮肤过敏，对蜜蜂无毒，属于低毒类物质。刘纲华等[5]研究了10%苯醚甲环唑水分散粒剂施用于黄瓜地后，其有效成分苯醚甲环唑在黄瓜和黄瓜地土壤中的消解速率较快，消解半衰期均低于10 d；在最后一次施药后7 d时，苯醚甲环唑在黄瓜中的最终残留量均低于0.1 mg/kg，这说明苯醚甲环唑在黄瓜地中属较易降解的农药。综上所述，苯醚甲环唑是一种安全，低毒，低污染环境和农副产品的杀菌剂。

2 苯醚甲环唑残留的最大残留限量

施用苯醚甲环唑为农作物的产量和品质提供了保证，但是不可避免地对环境造成污染，对人体和环境造成危害，残留问题备受关注。因此，我国制定了不同基质中苯醚甲环唑的检测方法（见表1），并且GB 2763-2016《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》[6]对其残留限量作了严格的规定，GB 2763-2016《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》明确规定了苯醚甲环唑在谷物、油料、油脂、蔬菜、水果、坚果、糖料、饮料和药用植物中的最大残留限量。苯醚甲环唑农药残留的检测标准见表1。

表1 苯醚甲环唑农药残留的检测标准Table 1 National standards of difenoconazole pesticide residues

续表1 苯醚甲环唑农药残留的检测标准Continue table 1 National standards of difenoconazole pesticide residues

由表1可知，苯醚甲环唑检测适用范围未全面覆盖食品领域，且GB 2763-2016《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》不能完全满足苯醚甲环唑检测标准的判定，对于蜂蜜、果汁、果酒、桑枝、金银花、枸杞子、荷叶、食用菌、牛奶和奶粉的最大残留限量没有制定判定标准。因此，制定更全面的苯醚甲环唑检测标准和不断完善GB 2763-2016《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》，对我国农产品中苯醚甲环唑农药残留的限量做出更严格的规定，形成基本覆盖主要农产品的完善配套的农药残留标准体系十分有必要。

3 苯醚甲环唑残留检测技术

3.1 样品前处理技术

现行用于苯醚甲环唑农药残留样品前处理的方法有液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）、液相微萃取（liquid phase microextraction，LPME）、固相萃取（solid phase extraction，SPE）、固相微萃取（solid phase microextraction extraction，SPME）、分子印迹固相萃取（molecular imprinting solid phase extractio，MISPE）和分散固相萃取（dispersive solid-phase extraction，DSPE；又称QuEChERS）等[16-18]，这些方法能够很好地减少基质干扰，具有操作简单、萃取效率高、省时省力、使用溶剂量少、对环境污染小等优点，在苯醚甲环唑农药残留分析样品前处理中的应用最为广泛。吸附材料是决定这些技术选择性和灵敏性的关键因素，常见传统的吸附材料有乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）、十八烷基硅烷键合硅胶（C18）、石墨化碳黑（graphitized carbon blacks，GCB）、 弗 罗 里 硅 土（Florisil）、氧化铝（Al2O3）、活性炭、硅胶及氨基填料（NH2）等。由于纳米材料的开发与应用成为前处理领域的研究热点和发展趋势，基于纳米材料在吸附容量、吸附速度、吸附选择性和使用成本等方面的优势，目前其在苯醚甲环唑农药残留分析中的应用已引起越来越多的关注和重视。课题组[19]制备了多壁碳纳米管（multiwalled carbon nanotubes，MWCNTs）固相萃取柱，提取液以MWCNTs固相萃取柱净化后用气相色谱法质谱检测，苯醚甲环唑检出限为0.001 mg/kg。方法选择性好，抗干扰能力强，适合蔬菜中苯醚甲环唑残留量的定性确证分析和定量分析。Chen等[20]合成了离子液体功能化的Fe3O4碳纳米管磁性分散固相萃取吸附材料，结合气相色谱法质谱分析了水中苯醚甲环唑。结果显示，该方法操作简单快速，灵敏度高，环境友好，检出限为0.16 ng/mL。

3.2 检测技术

3.2.1 气相色谱法

气相色谱（gas chromatograph，GC）利用被分析物质的沸点、极性和吸附性质的差异来实现混合物的分离。该方法将样品提取、净化、浓缩后的苯醚甲环唑注入气相色谱柱，苯醚甲环唑在固定相中分离，经检测器扫描出色谱图，通过保留时间来定性，通过峰面积与标准曲线来定量。该方法操作简单、分析速度快、分离效能高、选择性好等特点[21]。张春东等[22]建立了辣椒和土壤样品中苯醚甲环唑残留量的快速检测方法，样品于分液漏斗中用正己烷萃取，振荡提取3次，浓缩后正己烷定容，GC检测，线性范围为0.01 mg/L～1.00 mg/L，检出限为0.002 5 mg/kg。结果表明，正己烷提取辣椒和土壤中苯醚甲环唑效果较好，前处理过程不用过SPE小柱或层析柱等净化操作，它具有高效率、低成本、高灵敏度、定量准确等优点。毛久浪等[23]建立了QuECh－ERS联合GC测定毛豆样品中苯醚甲环唑残留量的方法，用该法检测了68个批次样品，其中20个毛豆仁样品苯醚甲环唑残留量均低于最大残留限量0.02 mg/kg，48个带荚毛豆样品中有13个样品中的苯醚甲环唑残留量大于0.02 mg/kg，证明苯醚甲环唑主要残留在毛豆荚中，去荚可降低毛豆仁苯醚甲环唑残留的风险，降低食用毛豆时暴露于苯醚甲环唑的风险。表2列举了应用GC进行苯醚甲环唑农药残留检测的实例，由表2可知GC测定苯醚甲环唑农药残留主要使用电子捕获检测器（electroncapture detector，ECD）检测器。

表2 苯醚甲环唑农药残留的GC检测实例Table 2 Examples of GC for determination of difenoconazole pesticide residues

3.2.2 高效液相色谱法

高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）主要适用于高沸点、热稳定差、不易气化或受热易分解的农药残留的定量测定。由于气相色谱方法需要较高的气化温度，而苯醚甲环唑存在异构体，在进样后的气化过程中立体结构易发生变化，高效液相色谱法可避免立体结构的变化而用于苯醚甲环唑农药残留分析检测。紫外吸收检测器（ultraviolet absorption detector，UV）不仅灵敏度高、噪声低、线性范围宽、有较好的选择性，而且对环境温度、流动相组成变化和流速波动不太敏感，既可用于等度洗脱，也可用于梯度洗脱，因此，HPLC-UV可应用于苯醚甲环唑农药残留的分析检测。Li等[28]报道了一种简单可靠的QuEChERS联合HPLC方法检测土壤和蔬菜中的苯醚甲环唑，苯醚甲环唑在 0.5 μg/mL～50 μg/mL 范围内呈良好的线性关系，检出限为0.1 μg/mL。该方法特异性强，精密度高，重现性好，不仅用于苯醚甲环唑及其代谢物的分析，而且成功检测了土壤、番茄和黄瓜中苯醚甲环唑的6种对映异构体。表3列举了应用HPLC进行苯醚甲环唑农药残留检测的实例。

表3 苯醚甲环唑农药残留的HPLC检测实例Table 3 Examples of HPLC for determination of difenoconazole pesticide residues

由表2和表3可知，与GC法相比，HPLC不需要考虑样品的挥发性和热稳定性，但是溶剂消耗大，检出限高，分析时间长，UV检测器没有ECD检测器灵敏度高，而且对样品的净化程度要求很高，但由于仪器价格便宜，普通检测实验室易于配备和使用，且操作维护简单，在苯醚甲环唑农药残留的检测中得到应用。

3.2.3 质谱法

质谱是称量离子的“天平”，其基本原理采用多种离子化技术将待测物质离子化，再经过质量分析器和检测器将这些离子按质荷比大小分离并排列成谱，然后通过标准品对照和质谱数据库检索，并结合特征离子的丰度值实现各组分的定性分析和定量分析。质谱以及色谱-质谱联用技术的应用，使样品的分离、定性和定量分析成为连续过程，与色谱的传统检测器相比，灵敏度更高，所需样品的用量更少、分析速度更快、应用范围更广，目前以质谱作为检测手段的农药残留分析方法已成为农药残留分析的主导技术和未来发展趋势。在各种色谱-质谱联用技术中，气相色谱-质谱连用技术（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、液相色谱-质谱连用技术（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）、气相色谱-串联质谱（gas chromatography tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）以及液相色谱-串联质谱（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）已在农药残留分析中得到广泛应用。

应用GC-MS和LC-MS检测苯醚甲环唑定性能力强，结果准确，分析速度快，但在复杂样品中存在严重基质干扰物及共流出物时，容易产生假阳性结果。GC-MS/MS和LC-MS/MS利用获得的离子丰富的结构信息，对苯醚甲环唑的结构加以确证，通过选择离子模式，可以使样品背景和噪音大大降低，在苯醚甲环唑农药残留的鉴定和定量分析中更具有优势。李洁等[32]在茶叶中采用丙酮提取，经TPP-固相萃取小柱净化后，用GC-MS/MS检测。试验结果表明，GC-MS/MS降低了苯醚甲环唑在实际检测中的假阳性和误判率，该方法的灵敏度较高、选择性较好、抗干扰能力较强，可用于茶叶中苯醚甲环唑残留的准确定量和定性分析。Chen等[16]比较了LPME联合HPLC法和QuEChERS联合LC-MS/MS法检测豇豆中苯醚甲环唑的方法。结果表明，LPME具有操作简单，环境友好的优点，QuECh－ERS具有净化效果好，重现性高的优点，LC-MS/MS比HPLC线性范围宽，灵敏度好，两种方法都得到满意的结果。质谱法分析苯醚甲环唑速度快，检出限低，可获得准确的定性和定量结果。但是，质谱仪价格昂贵，运行成本高，需要严格的操作技能，限制了它的应用，没有单纯用GC、HPLC普及。表4列举了应用MS进行苯醚甲环唑农药残留检测的实例。

3.2.4 其他方法

表面增强拉曼光谱（surface-enhanced raman spec－troscopy，SERS）指被检测物在一些特殊制备的金属导体（如金、银等）表面或溶胶中，拉曼散射信号比普通拉曼散射信号强度增加104倍～106倍的现象。SERS具有检测速度快、所需样本量小和操作简单等优点，在农药残留检测方面具有很大的应用潜力[43-44]。熊俊飞等[45]采用表面增强拉曼光谱技术结合快速溶剂前处理方法快速分析芹菜中苯醚甲环唑农药残留。利用乙腈提取芹菜汁，采用PSA、C18和GCB去除芹菜汁中的脂肪酸、蜡质、色素和固醇等荧光物质，样本的基底采用OTR202和OTR103金纳米颗粒作为表面增强试剂。结果表明，1192cm-1特征峰强度与以芹菜汁为基质的苯醚甲环唑溶液浓度在1 mg/L～10 mg/L范围内具有良好的线性关系，相关系数为0.962 2，最低检测浓度1 mg/L，回收率为 92.4%～113.2%，RSD在8.83%～12.4%之间。该方法操作简单，单个样本检测时间在20 min内完成，基本满足国家规定的残留限量要求。

表4 苯醚甲环唑农药残留的MS检测实例Table 4 Examples of MS for determination of difenoconazole pesticide residues

续表4 苯醚甲环唑农药残留的MS检测实例Continue table 4 Examples of MS for determination of difenoconazole pesticide residues

酶联免疫吸附技术（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是酶免疫测定技术中应用最广泛的技术，是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，通过酶与底物产生颜色反应，用洗涤法将液相中的游离成分除去后再进行定量测定。目前ELISA技术已被应用于诸多的食品检测领域，具有仪器成本低、方便、快捷、灵敏度高、检测结果准确等众多优势。同时存在难以分析多种成分，对某些结构类似物的分析检测仍会出现交叉反应影响检测结果，过度依赖试剂的选择等缺点[46-47]。刘冰等[48]研究了通过苯醚甲环唑半抗原的设计及合成，人工抗原的制备，多克隆抗体的制备及纯化，最终建立了苯醚甲环唑的直接竞争ELISA方法，其灵敏度 IC50为（67.96±2.73）μg/L，检测限 IC15为（8.86±0.34）μg/L，选取10种果蔬类样品，经正己烷提取，磷酸盐缓冲液稀释后，回收率为89.01%～103.43%，变异系数小于14.33%，检出限为0.443 mg/kg。本研究所建立的直接竞争ELISA方法，灵敏度和特异性较高，样品处理简单，为农产品中苯醚甲环唑残留的有效监管提供了一种高效的检测工具。

4 结论与展望

首先，目前苯醚甲环唑残留检测方法主要采用质谱法，但是质谱法对于复杂基质会出现假阳性结果。从当前的发展趋势看，采用串联质谱法建立苯醚甲环唑残留检测方法，开展苯醚甲环唑残留精准筛查已成为研究的重点，以及其在食品中的代谢规律研究将成为新的研究热点。其次，伴随生物传感技术和酶联免疫吸附技术的发展，今后开发具有操作简捷、成本低廉、高效灵敏的苯醚甲环唑残留快速检测方法，满足食品中苯醚甲环唑残留的现场快速检测是关键。再次，不断完善苯醚甲环唑农药残留检测标准，使其更全面覆盖我国食品领域。制定既符合我国又能与国际接轨的更细致的苯醚甲环唑农药残留限量标准，确保食品安全。最后，对于苯醚甲环唑农药残留是“产”出来的，而不是“检”出来的。因而，加强苯醚甲环唑农药使用的源头管理，树立科学的施药观念，提倡少用、不用和安全用药，从源头上消除苯醚甲环唑农药残留，提高农产品的安全水平，促进我国农产品的持续健康发展。