五种杀菌剂胁迫下灰葡萄孢产孢所需碳源种类分析

汪汉成, 蔡刘体, 刘文锋, 刘亭亭,3, 孙美丽,3,陆 宁, 陈兴江, 穆 青

(1. 贵州省烟草科学研究院，贵阳 550081；2. 湖北中烟工业有限责任公司技术中心，武汉 430040；3. 长江大学 农学院，湖北 荆州 434025；4. 贵州省烟草公司黔西南州公司，贵州 兴义 562400)

灰葡萄孢Botrytis cinerea是农业生产上的重要病原真菌，可引起植物灰霉病，其常见寄主有200 多种，可造成多种作物产前、产后的严重经济损失[1]。灰霉病具有潜伏期短、流行速度快等特点，在环境有利条件下，短时间内可产生大量分生孢子，分生孢子借助风雨的传播可造成病害大面积流行[2]。碳源是植物病原菌生存和产孢的重要营养物质，不仅影响病原菌的致病力，还影响其孢子的产生[3]。已有的研究表明，灰葡萄孢菌可利用的碳源种类丰富，包括多种糖类、氨基酸类等多种化合物[4]。然而，各类碳源化合物是否会影响灰葡萄孢分生孢子的形成尚缺乏了解。而分生孢子的形成与灰霉病的再侵染密切相关，了解碳源营养与灰葡萄孢分生孢子形成间的关系有助于增加对灰霉病再侵染规律的认识。

当前，化学防控仍是对作物灰霉病进行防控的主要手段。多菌灵、丙环唑、嘧霉胺、异菌脲和咪鲜胺等几种作用机制不同的杀菌剂在国内外均已被登记用于防控多种作物灰霉病[5-6]。作者前期研究发现，这些杀菌剂对灰葡萄孢碳源利用表现出不同的表型特征[5]，但杀菌剂对其分生孢子形成过程中所需碳源种类仍缺乏了解。为此，本文采用Biolog FF 板，测定了在上述5 种杀菌剂胁迫下灰葡萄孢的产孢情况，以期揭示灰葡萄孢孢子形成所需的的产孢碳源种类，以及杀菌剂对灰葡萄孢产孢所需碳源种类的影响，旨在为灰霉病的科学防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 菌株 灰葡萄孢Botrytis cinerea菌株H1，由贵州省烟草科学研究院微生物实验室前期通过分离、鉴定所得[7-8]。

1.1.2 药剂与试剂 80%多菌灵 (carbendazim) 原药，江苏蓝丰生物化工股份有限公司；95%丙环唑 (propiconazole) 原药，上海艾科思生物公司；96%嘧霉胺 (pyrimethanil) 原药，江苏耕耘化工有限公司；97.30%异菌脲 (iprodione) 原药，山东泰安圣聚华有限公司；96%咪鲜胺 (prochloraz) 原药，江苏辉丰农化股份有限公司。将多菌灵溶于0.20 mol/L 的稀盐酸，其余药剂均分别溶于甲醇，配制成质量浓度为1.0 × 104mg/L 的母液，于4 ℃下黑暗保存，备用。

Biolog FF 板 (货号：#1006)、FF-IF (#72106)接种液、OmniLog PM 系统 (#91171) 和8 通道电动移液器 (#3501A)，购自美国Biolog 公司。

1.2 灰葡萄孢对Biolog FF 板碳源的利用及其产孢情况

将灰葡萄孢于25 ℃黑暗条件下在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板上培养，5 d 后将平板置于15 ℃黑暗条件下培养24 h，菌落表面产生大量分生孢子，使用无菌水润湿的无菌棉签在菌落表面旋转蘸取分生孢子，将其定容至12 mL 的FFIF 接种液中，将孢子悬浮液浓度调至62% T (T 为Biolog 标准浓度单位)[9]。用8 通道电动移液器将混匀后的孢子悬浮液添加至Biolog FF 板中，每孔100 μL。将Biolog FF 板置于OmniLog 恒温培养箱中，于25 ℃培养7 d，设置OmniLog 工作软件，收集数据。根据灰葡萄孢的代谢曲线，分析其碳源利用表型特征[5]。同时，肉眼观察灰葡萄孢在Biolog FF 板各孔上的产孢情况，有灰色孢子形成的孔，其孔内碳源视为能促进灰葡萄孢产孢的碳源，记录碳源的种类。

1.3 5 种杀菌剂胁迫下灰葡萄孢产孢所需碳源种类分析

参照1.2 节的方法准备灰葡萄孢的分生孢子。根据灰葡萄孢对5 种杀菌剂的敏感性[7-8]，用FFIF 接种液配制各药剂系列浓度的测试液。多菌灵的最终测试质量浓度为0、0.05、1 mg/L，丙环唑为0、1、10 mg/L，嘧霉胺为0、0.08、1 mg/L，异菌脲为0、0.1、5 mg/L，咪鲜胺为0、0.04、5 mg/L。参照1.2 节的方法配制各药剂测试浓度的灰葡萄孢分生孢子接种液，并检测在药剂胁迫下分生孢子的形成情况，肉眼观察并记录在各种杀菌剂胁迫下灰葡萄孢产孢所需碳源种类。

2 结果与分析

2.1 灰葡萄孢对Biolog FF 板碳源的利用及其产孢情况

灰葡萄孢在Biolog FF 板上培养7 d 后，其对Biolog FF 板上碳源的利用及其产孢情况见表1。灰葡萄孢能利用糖类、氨基酸类等92 种碳源，其中高效利用的有L-阿拉伯糖、熊果苷、D-纤维二糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、蔗糖和麦芽三糖等；不能利用的碳源有异L-果糖、葡萄糖醛酰胺和L-乳酸。灰葡萄孢能利用且能产孢的碳源有35 种，包括苦杏仁苷、L-阿拉伯糖、甘油等；能利用但不能产孢的碳源有57 种，包括吐温80、D-阿拉伯糖、葡萄糖醛酸和D-山梨糖醇等。

表1 灰葡萄孢对Biolog FF 板碳源的利用及其产孢情况Table 1 Carbon substrate utilization and sporulation of Botrytis cinerea on Biolog FF microplate

续表1Table 1 (Continued)

2.2 5 种杀菌剂胁迫下灰葡萄孢的产孢碳源种类

灰葡萄孢在5 种杀菌剂不同浓度下均表现出不同的碳源利用特性[5]，其在Biolog FF 板上的产孢碳源情况存在差异 (表2)。用多菌灵0.05 mg/L、丙环唑1 mg/L、嘧霉胺0.08 mg/L、异菌脲0.1 mg/L及咪鲜胺0.04 mg/L 处理时，灰葡萄孢可产孢的碳源种类分别为12、4、36、38 及37 种；用多菌灵1 mg/L、丙环唑10 mg/L、嘧霉胺1 mg/L、异菌脲5 mg/L 及咪鲜胺5 mg/L 处理时，灰葡萄孢能产孢的碳源种类分别为6、3、36、34 及5 种。

表2 5 种杀菌剂胁迫下灰葡萄孢在Biolog FF 板上产孢的碳源种类Table 2 Carbon substrates for sporulation of Botrytis cinerea under five different fungicide pressures on Biolog FF microplate

续表2Table 2 (Continued)

在多菌灵胁迫下，能促进灰葡萄孢产孢的碳源主要为多糖类碳水化合物，包括β-环式糊精、D-核糖等；随着药剂质量浓度的增加，部分碳源被抑制，如L-阿拉伯糖、D-半乳糖、肝糖和麦芽糖等。在丙环唑1 和10 mg/L 胁迫下，能促进灰葡萄孢产孢的碳源种类基本一致，主要为多糖类碳水化合物D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖和β-环式糊精；此外，病原菌在1 mg/L 的丙环唑胁迫下还能利用熊果苷并产孢。在嘧霉胺0.08 和1 mg/L 胁迫下，灰葡萄孢能产孢的大部分碳源种类一致，包括麦芽糖、麦芽三糖、β-环式糊精等36 种碳源。在异菌脲0.1 和5 mg/L 胁迫下，灰葡萄孢能产孢的大部分碳源种类一致，包括N-乙酰基-β-D-葡萄糖胺、麦芽三糖、D-甘露醇、D-苷露糖等30 多种碳源。在咪鲜胺1 mg/L 胁迫下，灰葡萄孢能产孢的碳源种类较多，包括核糖醇、杏苷、麦芽三糖、D-甘露醇等37 种碳源；在咪鲜胺10 mg/L 胁迫下，灰葡萄孢能产孢的碳源仅为D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖胺、D-核糖及D-木糖。

3 讨论

Biolog FF 板中含有单糖、多糖、醇类、氨基酸类等95 种碳源，不同微生物对不同碳源会表现出不同的代谢指纹图谱，该技术已被广泛应用于真菌的鉴定[10-11]。本文采用代谢技术分析了灰葡萄孢对Biolog FF 板碳源的利用及其在5 种杀菌剂胁迫下的产孢情况，结果揭示了不同作用机制杀菌剂胁迫下灰葡萄孢产孢所需碳源种类。

不同烟草微生物在Biolog FF 板上表现出不同的代谢表型。已有的研究发现，烟草九州镰孢菌Fusarium kyushuense能利用的碳源有89 种，但其不能利用N-乙酰基D-半乳糖胺、N-乙酰基-β-D-葡萄糖胺、葡萄醛酰胺、癸二酸、L-丝氨酸和腺苷-5′-磷酸盐6 种碳源[12]；源自烟草育苗基质的哈慈木霉Trichoderma harzianum和棘孢木霉Trichoderma asperellum分别能利用57 和55 种碳源，其中24 种能促进其大量产孢，包括D-纤维二糖、糊精、赤藓糖醇和D-果糖[13]。作者前期研究发现，灰葡萄孢能高效利用的碳源有29 种，主要包括N-乙酰基-β-D-葡萄糖胺、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯醇和熊果苷[5]，本文结果与前文基本一致。上述九州镰孢菌、哈慈木霉、棘孢木霉及灰葡萄孢均能产

孢的碳源有D-阿拉伯糖、熊果苷等20 余种，这些碳源可能是大部分丝状真菌生存和产孢的重要营养碳源，有关碳源对真菌孢子形成的生化机理有待下一步研究。此外，灰葡萄孢菌的寄主广泛，本文仅检测了源自烟草灰葡萄孢的碳源利用特征，来自其他寄主的灰葡萄菌的相关研究也有待开展。

Biolog FF 板的碳源代谢均发生于不同的生物化学反应途径中，可用于杀菌剂作用机理的研究。基于此技术研究发现，嘧菌酯和醚菌酯均可抑制九州镰孢菌F. kyushuense的糖酵解和三羧酸循环生化途径中大部分碳源的代谢[14]；啶酰菌胺可抑制灰霉病菌三羧酸循环途径中大部分碳源的代谢，多菌灵对灰葡萄孢糖酵解途径的碳源代谢没有抑制活性，异菌脲和嘧霉胺对灰葡萄孢碳源代谢的抑制活性较弱，丙环唑可抑制灰葡萄孢所有生化途径碳源的代谢[5]。除研究杀菌剂对灰葡萄孢的碳源代谢表型外，本文进一步明确了5 种不同作用机理杀菌剂胁迫下灰葡萄孢产孢所需的碳源种类。作用于细胞核分裂期β微管蛋白形成的多菌灵[15]和作用于麦角甾醇形成的咪鲜胺[16]在高剂量胁迫时，均可减少灰葡萄孢产孢所需碳源的种类；作用于甾醇合成的丙环唑[17]在低剂量和高剂量胁迫下，均可减少其产孢所需碳源的种类。由此推测，多菌灵、咪鲜胺和丙环唑可影响灰葡萄孢产孢相关的生化途径。作用于甲硫氨酸合成的嘧霉胺[18]和作用于组氨酸激酶的异菌脲[19]在本文测试浓度下，对灰葡萄孢产孢所需碳源基本无影响，推测这两种药剂不作用于灰葡萄孢产孢相关生化途径。各药剂抑制灰葡萄孢产孢所需碳源种类的差异及其机理有待进一步研究。

综上，使用嘧霉胺和异菌脲防控作物灰霉病存在灰葡萄孢继续产生大量分生孢子的风险。相比而言，丙环唑、咪鲜胺和多菌灵在抑制分生孢子形成上更具优势。