上海地产葡萄和草莓中植物生长调节剂残留及膳食摄入风险评估

李晓贝, 吴海平, 赵晓燕, 陈 磊*,,周昌艳, 李健英, 何香伟

(1. 上海市农业科学院 农产品质量标准与检测技术研究所，上海 201403；2. 普研(上海)标准技术服务股份有限公司，上海 201318)

据联合国粮农组织 (FAO) 报告[1]，2019 年中国大陆地区葡萄种植面积为74.6 万公顷，产量1437万吨，草莓种植面积12.6 万公顷，产量322 万吨，是世界上最大的葡萄和草莓生产国及消费国，2019 年中国的草莓消费量是世界排名第二的美国的2 倍[2]。近年来，植物生长调节剂 (plant growth regulators，PGRs) 已被广泛应用于葡萄及草莓的生产中，用于提高植株的成活率、抗病性和果实的座果率、成熟度、耐贮性、单果重，以及抑制枝蔓疯长、促进葡萄无籽化形成等[3-4]。

虽然我国目前已对60 多种PGRs 有效成分进行了登记[5]，但登记用于草莓上的仅2,4-表芸苔素内酯及噻苯隆2 种，在葡萄上登记的有赤霉酸、氯吡脲、脱落酸等15 种，且多数尚未制定相应的最大残留限量 (MRL) 。PGRs 在生产中的必要性和监管的不足，使得滥用及不规范使用现象日益突出。杨桂玲等[6]对浙江省290 批次葡萄样品中的77 种农药 (包括6 种PGRs) 残留进行了检测，结果显示，检出率最高的农药品种为复硝酚钠和脱落酸，其中复硝酚钠的长期膳食摄入风险高于0.01%。2015 年，欧洲食品安全局 (European Food Safety Authority，EFSA)[7]所提交的农药残留报告显示，葡萄中乙烯利超标率为19.8% (MRL 值为0.7 mg/kg) ，2018年[8]的报告显示，乙烯利在葡萄中的短期膳食摄入风险商最大值为161%。班思凡等[9]对北京、河北、山东、安徽和辽宁的120 个草莓样品进行了农药残留检测，共检出复硝酚钠、芸苔素内酯、多效唑、赤霉酸及氯吡脲5 种PGRs，其中复硝酚钠检出率为99.2%。目前我国关于葡萄和草莓中农药残留风险的研究中，以PGRs为焦点的报道极少。

作为上海市的特色种植产品，2018 年上海葡萄产量为6.57 万吨，草莓产量为2.58 万吨[10]，且连续几年种植面积及产量均相对稳定，以鲜食及本地消费为主，但是关于上海地产葡萄、草莓中PGRs 的使用及残留风险等情况却尚未见报道。笔者实地调研发现，上海市葡萄生产中施用PGRs已呈常态化，而草莓中 “膨大剂”、“激素” 等的安全问题亦是消费者关注的焦点。鉴于此，本研究对上海市主产区及代表性消费区域的葡萄和草莓产品中的PGRs 开展了调研与残留监测，并初步对其膳食摄入风险进行了评估，旨在明确上海市地产葡萄、草莓中PGRs 的实际使用情况及残留风险，为进一步提高上海市葡萄、草莓的安全生产水平及降低消费者的膳食摄入风险提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 葡萄及草莓样品 根据上海市葡萄和草莓的生产及种植情况，通过实地调研方式，于2018–2019 年分别在上海市葡萄、草莓主要生产基地共采集样品243 份。其中葡萄样品152 份，采集自奉贤区、嘉定区、金山区及浦东新区的26 个葡萄生产基地，主要为巨峰、醉金香、夏黑、巨玫瑰、金手指等主栽品种；草莓样品91 份，采集自奉贤区、嘉定区、金山区、青浦区及浦东新区的53 个草莓生产基地，主要品种为章姬和红颜。

1.1.2 药剂及试剂 20 种植物生长调节剂标准品：2,4-滴 (2,4-D) 、多效唑 (paclobutrazol) 、赤霉酸 (gibberellic acid) 及丁酰肼 (daminozide) ，均为100 mg/L 甲醇溶液 ；二氯吡啶酸 (clopyralid) 、矮壮素 (chlormequat chloride) 、噻苯隆 (thidiazuron)、吲哚-3-乙酸 (indoleacetic acid) 及胺鲜酯 (diethyl aminoethyl hexanoate) ，均为100 mg/L 乙腈溶液；脱落酸 (abscisic acid) ，1000 mg/L 甲醇溶液；6-苄基腺嘌呤 (6-benzylaminopurine) ，100 mg/L 乙腈-丙酮溶液；氯吡脲 (forchlorfenuron) ，10 mg/L甲醇溶液；甲哌啶 (mepiquat chloride)，10 mg/L水溶液；4-氯苯氧乙酸钠 (4-chlorophenoxyacetic acid)，纯度 98.0%；萘乙酸 (1-naphthaleneacetic)，纯度98.0% ；抗倒酯 (inabenfide)，1 000 mg/L 乙腈溶液；2,3,5-三碘苯甲酸 (2,3,5-triiodobenzoic acid)，纯度 98.0%。以上购自德国Dr. Ehrenstorfer公司。烯效唑 (uniconazole) ，100 mg/L 甲醇溶液；芸苔素内酯 (brassinolide)，纯度 ≥90.0%。购自上海安谱公司。乙烯利 (ethephon)，100 mg/L 甲醇溶液 ，北京Bepure 公司。甲醇和乙腈为色谱纯，甲酸为优级纯，氯化钠为化学纯。

用甲醇分别将4 种固态标准品4-氯苯氧乙酸钠、萘乙酸、2,3,5-三碘苯甲酸和芸苔素内酯溶解，配成1 000 mg/L 的标准溶液，于 –20 ℃ 保存。分别配制5 类PGRs 混合标准工作溶液：1) 准确量取1 000 mg/L 的脱落酸、抗倒酯、4-氯苯氧乙酸钠、萘乙酸、2,3,5-三碘苯甲酸和芸苔素内酯标准溶液各0.1 mL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，配成10 mg/L 的混合标准溶液a (混标a)。2) 取100 mg/L 的 2,4-滴、6-苄基腺嘌呤、多效唑、赤霉酸、矮壮素、二氯吡啶酸、吲哚-3-乙酸、噻苯隆、丁酰肼、胺鲜酯、烯效唑及乙烯利标准溶液各0.5 mL 于5 mL 容量瓶中，用甲醇定容，配成5 mg/L 的混标b。3) 取10 mg/L 的氯吡脲和甲哌啶标准溶液各0.5 mL，合并，配成5 mg/L的混标c。4) 按V(混标a) :V(混标b) :V(混标c) :V(甲醇) =1 : 2 : 2 : 5 配得1 mg/L 的混标d。5) 按V(混标d) :V(甲醇) =1 : 1 配得0.5 mg/L 的混标e。混标a、b 于 –20 ℃ 保存，混标c、d、e 现用现配。

1.1.3 主要仪器设备 岛津LC-20AD 高效液相色谱-AB Sciex API 4000 三重四极杆串联质谱仪(HPLC-MS/MS，美国AB Sciex 公司) ；明澈-D24UVMilli-Q 纯水仪(德国默克Millipore 公司)；分析天平 [0.01 g 和0.000 1 g，梅特勒-托利多国际贸易(上海) 有限公司]。萃取盐包 (2 g MgSO4，1 g NaOAc) 及QuEChERS 净化管 (250 mg C18，750 mg MgSO4) ，北京迪科马科技有限公司。

1.2 检测方法

1.2.1 样品前处理 提取：称取已匀浆的待测样品5 g (精确至0.01 g) ，置于50 mL 离心管中，加入5 mL 含体积分数1%乙酸的乙腈溶液，快速振荡约30 s 后加入萃取盐包，涡旋混匀约1 min后，于4 000 r/min 下离心5 min。净化：取上层提取液于QuEChERS 净化管中，涡旋1 min 后于4000 r/min 下离心5 min；取0.5 mL 上清液至2 mL 微量离心管中，加入0.5 mL 体积分数为0.1%的甲酸水溶液，混匀后经0.22 μm 有机微孔滤膜过滤，待HPLC-MS/MS 分析。

1.2.2 测定条件 色谱条件：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱 (100 mm × 2.1 mm，3.5 μm)，柱温40 ℃，进样量10 μL，流速0.2 mL/min，梯度洗脱条件见表1。质谱条件：电喷雾离子源 (ESI) ，多重反应监测 (MRM) 模式，20 种PGRs 的质谱参数见表2。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Procedure of gradient elution

表2 植物生长调节剂质谱参数Table 2 Mass spectrum parameters of PGRs

1.3 膳食摄入风险评估

采用点评估方法[11]进行。1) 居民体重及膳食消费数据来源：中国居民葡萄和草莓的平均消费量参考王东群等[12]及延妮等[13]的数据，大份餐消费量数据参考 WHO/FAO “全球环境污染物监测规划/食品污染监测与评估项目 (GEMS/Food)” 中关于中国的数据[14]，结合GEMS/Food 中急性膳食消费人群分类以及中国区葡萄、草莓消费量数据和相应的体重数据设置人群分类 (表3)，其中儿童及一般人群体重参考GEMS/ Food[14]，孕龄妇女体重参考文献[15]。2) 残留量数据来源：未检出及低于检出限 (LOD) 的PGRs 统一赋值1/2 LOD[16-17]；平均残留量取赋值后葡萄和草莓样品中PGRs 的残留中值 (STMR) ；最高残留值 (HR) 分别为赋值后葡萄和草莓样品中PGRs 残留量的97.5 百分位点值。3) PGRs 的每日允许摄入量 (ADI) 及急性参考剂量 (ARfD) ：以农药残留专家联席会议 (JMPR)的数据为主，若JMPR 尚未制定相关数据，则参考欧盟、美国、日本等其他组织或国家的数据。

2 结果与分析

2.1 检测方法验证

在 5 g (精确至0.01 g) 葡萄和草莓空白样品中分别添加 3 个水平的PGRs 混合标准工作溶液：0.01 mg/kg (0.05 mL 混标 a + 0.1 mL 混标 b +0.1 mL 混标 c)、0.03 mg/kg (0.15 mL 混标 d) 及0.1 mg/kg (0.1 mL 混标 e) ，进行添加回收试验，每个添加水平重复6 次。采用空白样品基质提取液分别配制0.005 ～ 0.1 mg/L 系列质量浓度的基质匹配混合标准工作溶液，按照1.2 节方法测定，绘制基质匹配标准曲线。结果 (表3) 表明，在0.01、0.03 及0.1 mg/kg 3 个添加水平下，葡萄和草莓中20 种PGRs 的添加回收率在64%～115% 之间，相对标准偏差 (RSD) 为0.9%～9.1%，LOD 为0.0001～0.002 mg/kg，定量限 (LOQ) 为0.01 mg/kg，均满足残留检测要求[18]。

表3 方法的添加回收率、检出限 (LOD) 及定量限 (LOQ) (n=6)Table 3 Recovery, limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) (n=6)

2.2 上海地产葡萄和草莓中植物生长调节剂残留情况分析

152 份葡萄及91 份草莓样品中的20 种PGRs残留情况见表4，共检出了赤霉酸、脱落酸、矮壮素及吲哚-3-乙酸 4 种PGRs。其中，检出频次最高的为脱落酸，其在葡萄及草莓样品中均有检出，平均残留量分别为0.088 mg/kg 和 0.886 mg/kg，但目前针对葡萄和草莓均尚未制定脱落酸的MRL标准；其次为吲哚-3-乙酸，在草莓中检出率为67.0%，赋值后平均残留量为0.011 mg/kg，在葡萄中检出率为5.9%，赋值后平均残留量为0.011 mg/kg，目前亦尚未制定其MRL 标准；矮壮素在葡萄中检出8 次，我国目前也尚未针对葡萄制定矮壮素的MRL 标准[19]，按照食品法典委员会 (CAC)[20]对葡萄中矮壮素的MRL 规定，有4 份样品超标，超标率2.6%；赤霉酸仅在葡萄中检出4 次，按日本[21]规定的葡萄中赤霉素 (含赤霉酸) 的MRL 标准，4 份样品中的残留量均超标，超标率为2.6%。

表4 葡萄及草莓样品中植物生长调节剂的残留检出情况Table 4 PGRs detection of table grapes and strawberries

2.3 膳食摄入风险评估结果

未查询到吲哚-3-乙酸的ADI 值，故在此不对其进行评估。根据居民的每日膳食摄入量 [14]以及赤霉酸、脱落酸和矮壮素在葡萄中的残留量，分别计算我国成年人群 (平均体重61.8 kg)[15]的膳食摄入风险。长期膳食摄入风险评估结果 (表5) 显示：通过葡萄摄入赤霉酸和矮壮素的 %ADI 值分别为0.0005%及0.004%，均远低于100%，其平均膳食水平下的长期摄入风险可忽略；通过葡萄和草莓摄入脱落酸的总暴露量为1.63 × 10−4mg/(kg bw·d)，%ADI 值为0.001%，其平均水平下的长期膳食摄入风险也极低。

表5 葡萄和草莓中3 种植物生长调节剂的长期膳食摄入风险Table 5 Chronic risk exposure of three kinds of PGRs from the dietary of table grapes and strawberries

EFSA 认为，无需制定赤霉酸及脱落酸的急性参考剂量，也不需要评估其短期膳食摄入风险[22-23]。葡萄单果重为637 g (以串计) ，高于其大份餐消费量，其短期摄入风险评估时变异因子 (v) 取值3[14]，评估结果(表6)显示：通过葡萄摄入矮壮素对各类人群的短期膳食暴露量 (IESTI) 最大值为2.73 ×10−4mg/(kg bw·d)，%ARfD 值为0.55%，远低于100%，因此其短期膳食摄入风险在可接受范围。

表6 通过葡萄摄入矮壮素的短期膳食风险Table 6 Acute risk exposure to chlormequat chloride from table grape

3 讨论与结论

3.1 植物生长调节剂使用及检出情况

实地调研结果显示，上海地产各品种葡萄种植中普遍施用赤霉酸和氯吡脲，一般每年施用2 次，第一次在开花前10 ～ 14 d 喷施全株，起到拉长果穗的作用，第二次在开花后喷施或浸润果穗，起到保果、无籽、彭大颗粒等作用，直至采收 (2 ～ 3 个月后) 不再施用其他植物生长调节剂。检测结果显示，152 份葡萄样品中均未检出氯吡脲，仅检出赤霉酸 4 次。赤霉酸是一种广泛存在于高等植物中的生长激素，在萌发期的种子中含量最高，在果实成熟后期，游离态赤霉酸含量逐渐降低，主要以束缚型储存于种子中[25-26]。赤霉酸具有拉长果穗、膨大果粒等作用，已广泛用于葡萄的增产、提质及无籽化等方面[3]。本研究中赤霉酸超标的4 份样品可能是由于不合规施用外源赤霉酸，也可能是由于果实成熟度不足因而内源赤霉酸含量相对较高所致，因此需进一步规范赤霉酸在葡萄日常生产中的使用方式及葡萄产品的采收标准。草莓基地的调研结果则显示，上海地产草莓在生产全过程中均不施用PGRs。

脱落酸及吲哚-3-乙酸在葡萄和草莓中均有检出，二者均可由植物内源产生，且目前尚未制定这2 种PGRs 在葡萄和草莓中的MRL 标准。葡萄和草莓作为典型的非呼吸跃变型果实，对果实发育与成熟起调控作用的生长激素以吲哚-3-乙酸、赤霉素、脱落酸和芸苔素内酯等为主，没有激增的乙烯峰和剧变的呼吸峰[4]。脱落酸可促进果实的成熟，直接影响果实着色及香味形成等，在葡萄和草莓果实成熟后期具有相对稳定的高含量[27]，本研究中脱落酸100% 的高检出率结果与之一致。吲哚-3-乙酸的主要功能是促进细胞分裂以及延缓植物衰老，在葡萄和草莓成熟后期会逐渐降低直至果实成熟。本研究中，整体成熟度相对较高的葡萄样品中吲哚-3-乙酸检出率为5.9%，而基地采集的草莓样品中吲哚-3-乙酸检出率为67.0%，主要原因可能是因为基地草莓样品整体成熟度不足而非外源施用。矮壮素是人工合成的生长抑制剂类物质，可用于抑制枝梢旺长和新枝生长。陈国品等[28]的研究显示，葡萄果实中矮壮素的残留量与其施用浓度成正比。EFSA 的评估结果显示，将施用过矮壮素的秸秆类原料制成培养料后，矮壮素仍能被食用菌吸收且高频次检出[29]，说明矮壮素在植物体内具有良好的吸收性和稳定性。虽然我国目前尚未制定矮壮素在葡萄和草莓上的MRL 标准，但其施用过量或时机不当存在植株生长不良、果实品质降低等风险[30]， 因此在生产中需根据实际需要合理施用。

3.2 膳食摄入风险分析

据国家卫健委发布的《中国居民营养与慢性病状况报告》，我国居民一天的平均总膳食摄入量为969.2 g，其中水果消费量仅占4.2%[15]。本研究中检出的4 种PGRs 中，赤霉酸、吲哚-3-乙酸及矮壮素的平均残留量均低于0.01 mg/kg，最大残留量为0.50 mg/kg，整体残留水平相对较低。按照我国对农药的毒性等级划分标准，目前常用的PGRs 一般都属于低毒或者微毒级[31-32]，且赤霉酸和吲哚-3-乙酸在美国均属于豁免制定MRL的农药[33]。整体而言，葡萄及草莓本身的膳食摄入量低，测定表明上海地产葡萄和草莓中PGRs的残留水平也较低，而其ADI 值相对较高，因此居民通过葡萄和草莓摄入PGRs 的膳食风险可接受。

风险评估通常具有一定的不确定性，在本研究中主要表现在3 个方面：1) 仅以葡萄和草莓为单一暴露途径，未考虑由蔬菜、其他水果及粮食等其他食品暴露途径引入的膳食风险，即未能评估PGRs 的整体膳食摄入风险。2) 所采用的大份餐消费量数据来源于WHO/FAO 2012 年的统计结果，与当前中国居民的实际消费情况存在一定差异。3) 矮壮素的残留量最大值取其97.5 百分位点值进行计算，但是由于其检出率相对较低，所得风险估值可能低于其实际暴露水平。

3.3 结论

研究表明，上海地产葡萄和草莓中植物生长调节剂的整体残留水平及膳食摄入风险均较低。葡萄样品中共检出脱落酸、赤霉酸、矮壮素及吲哚-3-乙酸4 种PGRs 残留，其中脱落酸的检出率虽然高达100%，但其平均残留量仅0.088 mg/kg；另外3 种PGRs 的检出率则均低于6.0%，最大检出值为0.500 mg/kg。草莓中共检出了赤霉酸及吲哚-3-乙酸2 种PGRs 残留，其中脱落酸的检出率为100%，平均残留量为0.886 mg/kg；吲哚-3-乙酸检出率为67.0%，平均残留量为0.011 mg/kg。我国居民通过食用上海地产葡萄和草莓摄入4 种PGRs 的长期膳食暴露风险商 (%ADI) 最大值为0.004% (矮壮素)，远低于100%，长期膳食摄入风险可忽略；所检出的几种PGRs 中，仅矮壮素需要评估其短期膳食风险，结果表明，通过葡萄摄入矮壮素的短期膳食暴露风险商 (%ARfD)最大值为0.55%，同样远低于100%，其短期膳食摄入风险亦可接受。