三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫不同生长阶段的急性毒性比较
2015-03-14蒋金花吴声敢陈江滨吴长兴蔡磊明赵学平
蒋金花，吴声敢，陈江滨，吴长兴，蔡磊明，赵学平
浙江省农业科学院农产品质量标准研究所 省部共建国家重点实验室培育基地—浙江省植物有害生物防控重点实验室 农业部农药残留检测重点实验室，杭州 310021
三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫不同生长阶段的急性毒性比较
蒋金花，吴声敢，陈江滨，吴长兴，蔡磊明，赵学平*
浙江省农业科学院农产品质量标准研究所 省部共建国家重点实验室培育基地—浙江省植物有害生物防控重点实验室 农业部农药残留检测重点实验室，杭州 310021
为探明三唑酮对鱼类不同生长阶段的毒性效应，以斑马鱼和稀有鮈鲫为测试生物，检测了三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫不同生长阶段的急性毒性差异。研究发现，三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫胚胎为低毒，其96 h-LC50值分别为21.1 (14.4～31.0)和14.2 (9.65～20.9) mg·L-1；高浓度的三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫胚胎的孵化有明显的抑制作用，染毒96 h后，23.7 mg·L-1三唑酮组斑马鱼胚胎的孵化率为4.17%，22.5 mg·L-1三唑酮组稀有鮈鲫胚胎的孵化率为33.3%。三唑酮对斑马鱼仔鱼、幼鱼和成鱼为低毒，其96 h-LC50值分别为24.8、21.3、13.1 mg·L-1，三唑酮对稀有鮈鲫仔鱼、幼鱼和成鱼为中毒，其96 h-LC50值分别为9.96、7.89、6.89 mg·L-1。因此，三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫不同生长阶段的毒性效应排序一致，毒性从高到低顺序依次为：成鱼>幼鱼>仔鱼。试验结果表明，相对于斑马鱼，稀有鮈鲫对三唑酮的毒性作用更为敏感，三唑酮对稀有鮈鲫不同生长阶段的毒性均高于斑马鱼相应生长阶段的毒性。
三唑酮；斑马鱼；稀有鮈鲫；急性毒性
三唑酮是我国第一个商品化的三唑类杀菌剂，至今已有20多年的应用历史。由于其对作物多种病原菌具有高效、内吸、广谱的作用，而成为目前应用范围广、防治效果好、最具开发应用潜力的一类杀菌剂。三唑酮在农田施用后能够向土壤深处迁移和扩散，通过雨水的淋溶作用进入水体造成水体污染，进而影响水生生物。研究发现，三唑酮对斑马鱼成鱼96 h急性毒性为低毒，96 h-LC50值为13.8 (11.3～14.8) mg·L-1[1]，三唑酮可以造成斑马鱼胚胎畸形和眼睛发育不全[2]。随着三唑类杀菌剂的使用量逐年增加，其造成的环境风险也越来越受到重视，目前，已有大量三唑类杀菌剂包括三唑酮对哺乳动物毒理研究的文献报道，但三唑酮对水生生物不同生长阶段的毒性效应的研究较少，因此研究三唑酮对不同水生生物的毒性效应对评价三唑酮的环境风险和安全使用具有重要意义。
农药多数通过飘移或地下水渗漏进入水体造成水污染，鱼类是水环境中的主要生物之一，鱼类的生态毒理反应和变化可作为水环境评价的良好指标，因此以鱼类为受试对象的毒性试验在评价化学品环境效应方面起着重要作用。目前OECD、EPA、ISO等各国组织机构常用的生态毒性检测鱼种是斑马鱼(Danio rerio)，因其价格低廉、容易获得、管理饲养易行等诸多因素受到许多环保组织或国家的重视，他们已经将化学品对其急/慢性毒性效应作为评价污染物对水生环境危害程度的指标。我国尚没有建立起标准的实验鱼类，目前国内有能力提供生态毒性数据的实验室采用的试验用鱼还局限于国际通用种，缺乏本土生物的生态毒性数据不但影响了对化学品安全性的全面评价，也难以满足我国化学品管理的需要。2003年，我国颁布的《新化学物质环境管理办法》[3]中明确规定：“新化学物质的生态毒理学数据必须包括在中国境内用中国的供试生物完成的测试数据”，稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)被推荐为我国化学品毒性测试生物之一。稀有鮈鲫具有性成熟快、易于饲养，在实验室内可周年产卵、连续产卵等优点，20世纪90年代，中国科学院水生生物研究所就开始对其进行了基本生物学研究[4]。目前，中国科学院水生生物研究所、中国科学院生态环境研究中心等正利用稀有鮈鲫为试验材料在“评价内分泌干扰物长期低剂量暴露影响的鱼类实验模型”、“环境内分泌干扰物的生物筛选”等方面开展工作。但作为一种新兴实验鱼种来说，生态毒性数据还不全面，也没有形成完善的检测评价体系，目前关于化学品对稀有鮈鲫某一生长阶段的急性毒性或者慢性毒性效应研究较多[5-9]，但对于稀有鮈鲫和斑马鱼不同生长阶段的毒性差异研究还十分有限，为了更好的证实稀有鮈鲫是进行化学品毒性测试和环境水样毒性实验的模式生物，本研究以斑马鱼和稀有鮈鲫为供试生物模型，研究了三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫不同生长阶段的毒性效应，通过比较三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫的毒性差异，丰富稀有鮈鲫的毒性实验数据库，为稀有鮈鲫发展成为国际通用种提供理论数据支撑。试验结果对进一步研究三唑酮的致毒机制具有一定的现实意义，也为评价三唑酮的安全使用提供科学依据。
1 材料与方法(Materials and methods)
1.1 仪器与试剂
仪器：24孔细胞培养板和6孔细胞培养板均购自浙江拱东医疗科技有限公司，分别作为胚胎和仔鱼染毒器具。
试剂：三唑酮原药(97.1%)，江苏盐城利民农化有限公司；分析纯吐温-80，国药集团化学试剂有限公司；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，天津市福晨化学试剂厂。
1.2 实验材料
稀有鮈鲫种鱼购自江苏无锡中科水质环境技术有限公司，斑马鱼种鱼购自武汉中科院水生生物研究所的国家斑马鱼资源中心，AB型品系，本试验所用斑马鱼和稀有鮈鲫的胚胎、仔鱼、幼鱼和成鱼均系其繁殖所得。斑马鱼和稀有鮈鲫胚胎分别为同一天收集的健康胚胎；仔鱼为孵化后8日龄；幼鱼为孵化后55日龄；成鱼为3月龄。仔鱼、幼鱼和成鱼均于正式试验前24 h停止投饵。
试验用水为曝气除氯并经活性炭过滤的自来水，水温为(25±1) ℃，pH控制在6.5～7.5，光/暗比为14 h/10 h，溶解氧≥5.8 mg·L-1。
1.3 试验方法1.3.1 试验药液配制
三唑酮原药用吐温-80和DMF溶解，经超声混匀定容后配制成一定浓度的标准储备液，冷藏备用。试验时，用移液器吸取适量储备液加入定量的标准稀释水，超声混匀，按相应倍数逐级稀释至设计浓度。试验期间各试验容器内助溶剂DMF在水中最终浓度均未超过0.100 mg·L-1。标准稀释水按照《化学品鱼类急性毒性试验》[10]方法配制。
1.3.2 胚胎染毒试验
参考世界经济合作与发展组织(OECD)方法[11]，通过立体显微镜观察，挑选发育正常的健康受精卵供试。采用24孔细胞培养板，每孔加入2 mL供试药液并放入1枚受精卵。根据预备试验结果，设定三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫胚胎毒性试验浓度(表1)，按最高浓度组的助剂浓度设置助剂对照组，以稀释水为空白对照组。每浓度设2次重复，每重复为1个24孔板。
染毒期间环境温度为(25±1) ℃，光/暗比为14 h/10 h。每24 h更换1次溶液。试验期间分别于6、24、48、72、96 h时间点观察并记录死亡数、孵化数及相关中毒症状，并及时取出死亡个体。
1.3.3 仔鱼、幼鱼和成鱼试验
根据OECD TG 203[12]方法，设计不同生长阶段的斑马鱼和稀有鮈鲫急性毒性试验。根据预备试验结果，设定斑马鱼和稀有鮈鲫仔鱼、幼鱼和成鱼的试验浓度(表1)，按最高浓度组的助剂浓度设助剂对照组，以稀释水为空白对照组。
试验用水为曝气除氯并经活性炭过滤的自来水。仔鱼急性毒性试验采用6孔板，每孔放入3条仔鱼，设2次重复，每重复为1个6孔板；幼鱼和成鱼采用6 L鱼缸，每缸15条鱼，均设2次重复。仔鱼、幼鱼和成鱼的试验过程均采用“半静态法” ，每24 h更换1次药液。
表1 三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫不同生长阶段的急性毒性试验浓度Table 1 The acute toxicity concentration of triadimefon to different life stages of zebrafish and rare minnow
试验期间分别于6、24、48、72和96 h时间点观察并记录各组斑马鱼和稀有鮈鲫中毒症状及死亡情况，每隔24 h检查1次各组的pH值及溶解氧含量，并及时清除死鱼。
1.4 数据处理
用DPS数据处理系统(9.50标准版，浙江大学)计算斑马鱼和稀有鮈鲫胚胎、仔鱼、幼鱼和成鱼的LC50值及其95%置信区间，分析三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫各生长阶段的毒性差异。
2 结果(Results)
2.1 三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫胚胎的毒性效应2.1.1 致死效应
图1为斑马鱼胚胎经不同浓度三唑酮处理不同时间后的死亡率。最高试验浓度80.0 mg·L-1三唑酮处理组24 h时胚胎的死亡率为29.2%，在48 h时死亡率已达100%；在24～96 h内，53.3、35.6、23.7、15.8、10.5、7.02 mg·L-1三唑酮处理组的胚胎死亡率
图1 三唑酮对斑马鱼胚胎死亡率的影响
逐渐增加，96 h时死亡率分别为87.5%、58.3%、29.2%、 20.8%、8.30%、4.17%。相对于药剂处理组，空白对照组和助剂对照组对斑马鱼胚胎的死亡率没有影响。
图2为稀有鮈鲫胚胎经不同浓度三唑酮处理不同时间后的死亡率。在24～96 h内，随着暴露时间的延长，三唑酮各浓度处理组的胚胎死亡率逐渐增加，72 h后各处理组的死亡率显著增加；在96 h时，4.44、6.67、10.0、15.0和22.5 mg·L-1试验组的死亡率分别为0%、16.7%、27.8%、50.0%和83.3%。稀有鮈鲫孵化时间约为卵产出后72 h，因此72 h为其孵化出卵壳的关键时间，从图2可见，72～96 h为三唑酮对稀有鮈鲫胚胎毒性作用最明显的时间段。相对于药剂处理组，空白对照组和助剂对照组对稀有鮈鲫胚胎的死亡率没有影响。
结果表明，三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫胚胎的毒性随处理浓度的增大而增加，同时随暴露时间的延长而增加，显示一定的剂量-效应和时间-效应关系。
图2 三唑酮对稀有鮈鲫胚胎死亡率的影响
表2为96 h 时三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫胚胎的半致死浓度(LC50)及95%置信区间。从中可看出，三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫胚胎96 h-LC50值分别为21.1 (14.4～31.0)和14.2 (9.65～20.9) mg·L-1,因此稀有鮈鲫胚胎对三唑酮比较敏感，三唑酮对稀有鮈鲫胚胎的毒性高于斑马鱼胚胎。
2.1.2 亚致死效应
图3为不同浓度三唑酮处理后斑马鱼胚胎孵化率的变化趋势。在三唑酮作用下，斑马鱼胚胎孵化率随着三唑酮浓度的增大而降低，高浓度的三唑酮对斑马鱼胚胎的孵化有明显的抑制作用，35.6 mg·L-1的三唑酮可以完全抑制胚胎的孵化。染毒96 h后，23.7、15.8、10.5、7.02 mg·L-1的三唑酮对斑马鱼胚胎的孵化率分别为4.17%、50.0%、91.7%、91.7%。空白对照组和助剂对照组对斑马鱼胚胎的孵化率没有影响。
图4为不同浓度三唑酮处理后对稀有鮈鲫胚胎孵化的影响。稀有鮈鲫胚胎孵化的最早时间为染毒48 h后，22.5 mg·L-1的三唑酮对稀有鮈鲫胚胎的孵化有明显的抑制作用，染毒72和96 h时，22.5 mg·L-1的三唑酮对稀有鮈鲫胚胎的孵化率分别为27.8%和33.3%。其余浓度(4.44～15.0 mg·L-1)对稀有鮈鲫胚胎孵化的影响与空白对照和助剂对照组相近。
试验表明，高浓度的三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫胚胎的孵化都有一定程度的抑制作用。在相同培养条件下，三唑酮对斑马鱼胚胎孵化的影响高于对稀有鮈鲫胚胎孵化的影响。
2.2 三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫仔鱼、幼鱼和成鱼的急性毒性
研究发现，随着三唑酮浓度的增加，斑马鱼和稀有鮈鲫仔鱼、幼鱼和成鱼的死亡率都出现逐渐上升的趋势，说明三唑酮和毒性之间存在剂量-效应关系。试验期间，经三唑酮染毒处理后，中毒症状随浓度的提高而越发明显。高浓度的三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫成鱼的毒性作用比较明显，染毒初期主要表现为快速游动，焦躁不安，随着染毒时间的延长，鱼游动变得迟缓，对外界刺激变得迟钝，个别鱼出现侧翻失衡及沉底现象，最终死亡。三唑酮处理后，斑马鱼和稀有鮈鲫仔鱼和幼鱼的早期中毒症状不明显，随着染毒时间延长，个别鱼体出现侧翻，脊柱弯曲或者鱼体变白腐烂等中毒症状。低浓度三唑酮处理组的斑马鱼和稀有鮈鲫无异常症状，与空白对照和助剂对照组基本相似。
图3 三唑酮对斑马鱼胚胎孵化率的影响
表2 三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫胚胎的急性毒性 (96 h)Table 2 The acute toxicity of triadimefon to the embryo of zebrafish and rare minnow (96 h)
图4 三唑酮对稀有鮈鲫胚胎孵化率的影响
三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫3个不同生长阶段的急性毒性见表3，三唑酮对斑马鱼仔鱼、幼鱼和成鱼的96 h-LC50值分别为24.8、21.3、13.1 mg·L-1，三唑酮对稀有鮈鲫仔鱼、幼鱼和成鱼的96 h-LC50值分别为9.96、7.89、6.89 mg·L-1，因此，三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫不同生命阶段的毒性从高到低顺序依次为：成鱼>幼鱼>仔鱼。研究表明，稀有鮈鲫对三唑酮比较敏感，三唑酮对稀有鮈鲫不同生命阶段的毒性均高于斑马鱼相应生长阶段的毒性，与三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫胚胎的毒性结果一致。
3 讨论(Discussion)
毒性研究是热点问题，一般情况下，以一种鱼类模式生物的急性毒性结果作为化学品的生态毒理学数据，可能会造成对本土生物的欠保护或过保护，也无法对化学品安全性作出全面的评价。本试验分别以胚胎、8日龄仔鱼、55日龄幼鱼和3月龄成鱼为研究样本，以国际通用种斑马鱼和我国特有种稀有鮈鲫为测试生物，研究了三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫不同生长阶段的急性毒性影响。三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫的毒性影响涵盖了鱼类生长的整个生命周期，所得结果可以为三唑酮的毒性效应以及生态风险评价提供基础数据。通过比较三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫不同生长阶段的毒性效应，丰富本土生物稀有鮈鲫的毒性实验数据库，以完善相关毒性效应研究的基础数据，满足我国化学品管理的需要，并为制定合理的测试导则提供参考，也为选择更为合适的本土模式生物来评价不同化合物的毒性效应提供数据支撑。
在相同培养条件下，高浓度的三唑酮对斑马鱼胚胎的孵化有明显的抑制作用，35.6 mg·L-1的三唑酮可以完全抑制胚胎的孵化，染毒96 h后，23.7 mg·L-1三唑酮组中斑马鱼胚胎孵化率为4.17%，22.5 mg·L-1三唑酮组中稀有鮈鲫胚胎的孵化率为33.3%。由此可见，三唑酮对斑马鱼胚胎的孵化影响高于对稀有鮈鲫胚胎孵化的影响。三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫不同生长阶段的急性毒性测定结果显示，三唑酮对斑马鱼仔鱼、幼鱼和胚胎的毒性相当，96 h-LC50值分别为24.8、21.3和13.1 mg·L-1，斑马鱼成鱼对三唑酮最为敏感，稀有鮈鲫不同生命阶段对三唑酮毒性的敏感性从高到低顺序依次为：胚胎>成鱼>幼鱼>仔鱼(96 h-LC50值分别为14.2、9.96、7.89、6.89 mg·L-1)。根据国家环境保护局制定的《化学农药环境安全评价试验准则》[13]中将农药对鱼类的毒性等级划分为4个等级：剧毒，LC50≤0.1 mg·L-1；高毒，0.1
表3 三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫不同生长阶段的急性毒性 (96 h)Table 3 The acute toxicity of triadimefon to different life stages of zebrafish and rare minnow (96 h)
欧盟(EU)和世界自然基金(WWF)把三唑酮列为具有生殖和内分泌干扰毒性的杀菌剂之一。三唑酮主要通过影响甾醇14-α脱甲基酶(CYP51)和芳香酶(CYP19)，从而影响类固醇生成，具有一定的拟雌激素活性[14]。研究发现，三唑酮对小鼠和斑马鱼胚胎发育过程中的类固醇合成途径中关键元件的基因表达具有一定的调控作用[15-16]。同时，三唑酮对大鼠和人类肝脏细胞具有相同的毒性效应，可以调控雌雄激素代谢，脂肪酸以及固醇和类固醇代谢途径相关基因的表达[17]。现有研究表明，三唑酮对不同的生物具有类似的毒性效应，但其具体的毒性机制还有待进一步研究。已有报道显示，三唑酮对日本青鳉不同生命阶段的毒性为仔鱼>幼鱼>成鱼(96 h-LC50值分别为12.5、11.0、0.354 mg·L-1[18])，说明三唑酮对斑马鱼、稀有鮈鲫和日本青鳉不同生长阶段的毒性差异大，三唑酮对日本青鳉不同生长阶段的毒性均高于斑马鱼，日本青鳉成鱼对三唑酮最为敏感。斑马鱼、日本青鳉和稀有鮈鲫不同生长阶段对三唑酮敏感性差异的具体原因，应该从这3种生物的基因组差异来进一步研究，从分子和蛋白水平来研究三唑酮对斑马鱼、日本青鳉和稀有鮈鲫的胚胎毒性、致畸性、神经毒性以及内分泌干扰效应，进一步讨论三唑酮的致毒机制。
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Acute Toxicity Effects of Triadimefon on Different Life Stages of Zebrafish (Daniorerio) and Chinese Rare Minnow (Gobiocyprisrarus)
Jiang Jinhua, Wu Shenggan, Chen Jiangbin, Wu Changxing, Cai Leiming, Zhao Xueping*
State Key Laboratory Breeding Base for Zhejiang Sustainable Pest and Disease Control, Key Laboratory for Pesticide Residue Detection of Ministry of Agriculture, Institute of Quality and Standard for Agro-Products, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China
Received 18 November 2014 accepted 30 December 2014
To explore the toxic effects of triadimefon on fish at different life stages, the differences in acute toxicity of triadimefon to zebrafish (Danio rerio) and Chinese rare minnow (Gobiocypris rarus) at different life stages were evaluated. The results showed that triadimefon was low toxic to the embryos of both zebrafish and rare minnow, and the 96 h-LC50value was 21.1 (14.4～31.0) and 14.2 (9.65～20.9) mg·L-1, respectively. An obvious inhibition of embryos hatching for both fish was observed after the exposure to high concentration of triadimefon for 96 h, and the hatching rate was 4.17% and 33.3%when the embryos of zebrafish and rare minnow were exposed to 23.7 and 22.5 mg·L-1triadimefon, respectively. Triadimefon exhibits low toxic to the larvae, juvenile, and adult of zebrafish with the 96 h-LC50values of 24.8, 21.3, and 13.1 mg·L-1respectively. Triadimefon shows moderately toxic to the larvae, juvenile, and adult of rare minnow with the 96 h-LC50values of 9.96, 7.89, and 6.89 mg·L-1. The trend of triadimefon acute toxicity to zebrafish and rare minnow at different life stages was the same: adult>juvenile>larva, and rare minnow was more sensitive to triadimefon during different life stages compared with zebrafish.
triadimefon; zebrafish (Danio rerio); Chinese rare minnow (Gobiocypris rarus); acute toxicity
浙江省农业科学院科技创新能力提升工程项目
蒋金花(1985-)，女，博士，研究方向为农药毒理学，E-mail: jinhuajjh@sina.com；
*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: zhaoxueping@tom.com
10.7524/AJE.1673-5897.20141118002
2014-11-18录用日期：2014-12-30
1673-5897(2015)5-150-07
X171.5
A
赵学平(1969-)，男，本科，研究员，主要研究方向为农药应用与毒理学，发表学术论文60余篇。
蒋金花, 吴声敢, 陈江滨, 等. 三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫不同生长阶段的急性毒性比较[J]. 生态毒理学报，2015, 10(5): 150-156
Jiang J H, Wu S G, Chen J B, et al. Acute toxicity effects of triadimefon on different life stages of zebrafish (Danio rerio) and Chinese rare minnow (Gobiocypris rarus) [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(5): 150-156 (in Chinese)
