丁氟螨酯在蚯蚓体内的富集及其急性毒性

石琳琳, 杨灿灿, 陈 琪, 徐 军, 张 平*,, 何 林*,

(1. 西南大学 植物保护学院，重庆 400715；2. 中国农业科学院 植物保护研究所，北京 100193)

丁氟螨酯 (CYF) 是一种使用广泛的新型手性高效杀螨剂，可以有效防控红蜘蛛的各个生长阶段，已在全世界范围内商业化并用于多种农作物[1]。目前，关于丁氟螨酯的研究主要集中在土壤中的降解和代谢途径以及对靶标生物的毒理学方面[2]。研究表明，丁氟螨酯对环境存在一定的风险性[2]，不合理使用会造成土壤中CYF 的沉积量不断增加。农药对土壤环境影响的评估，主要通过其对土壤系统中微生物的影响以及对土壤中非靶标生物的毒性等研究进行。据报道，丁氟螨酯对映体会影响土壤微生物的结构，甚至会破坏原有的土壤氮循环功能，最终对生态环境造成负面影响[3]。而丁氟螨酯在土壤中对非靶标生物的毒理学研究尚未见文献报道。

蚯蚓作为土壤中的主要非靶标动物对土壤富集营养和有机物、无机物的分解有着极其重要的作用[4]，它可以分解土壤中死去的有机物，同时也是许多物种的重要食物来源[5]。由于蚯蚓对农药的刺激十分敏感，通常被作为土壤污染监测最为敏感的生物标志物[6]。鉴于此，本研究通过研究丁氟螨酯在蚯蚓体内富集能力以及对其体重的影响，评估了丁氟螨酯的环境风险，以期为全面评价新型乙腈类杀螨剂丁氟螨酯提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料与仪器

98%丁氟螨酯消旋体 (Rac-CYF) 购于北京华威锐科公司，(−)-CYF 和 (+)-CYF 为本实验室分离得到，纯度亦均为98%。分析纯乙醇、正己烷、异丙醇、1%乙酸、丙酮、无水硫酸钠和氯化钠购于Amida Chemical Co., Ltd；0.22 μm 滤膜购于西南大学文化用品百货公司。其他试剂均为分析纯或色谱纯。供试蚯蚓为赤子爱胜Eisenia fetida，购于青岛瓦力生物科技有限公司。供试前于 (20 ±2)℃、相对湿度80%条件下适应环境2 周。挑选体重均匀[(0.4 ± 0.02) g]、带有生殖环的蚯蚓，置于滤纸上进行12 h 的清肠处理。试验用土为人工土，由70%沙土、20%高岭土和10%泥炭藓 (质量分数) 组成，用碳酸钙调节pH 值为6.0 ± 0.5，完全符合经合组织 (OECD) 人工土配制标准[7]。

Shimadzu LC-20AD 正相液相色谱仪 (日本Shimadzu 公司)；高速组织捣碎机 (上海齐欣科学仪器有限公司)；ZWY-240 恒温培养振荡器 (上海智诚分析仪器制造有限公司)；RE-52AA 旋转蒸发器 (上海亚荣生化仪器公司)；3-5N 台式低速离心机 (湖南恒诺仪器设备有限公司)。

1.2 丁氟螨酯对映体在蚯蚓体内富集情况检测

向已配制好的人工土中添加CYF，添加水平为10 mg/kg 的CYF 消旋体，其两个等量对映体均为5 mg/kg，将蚯蚓暴露于含药土壤中。分别于处理后2、4、7、9、12、14 和21d 取样检测对映体在蚯蚓体内富集情况。按公式 (1) 计算生物-土壤富集因子(BSAF)[8]。

式中，ce为蚯蚓体内对映体浓度，单位 mg/kg；cs为土壤中对映体浓度，单位 mg/kg。

1.3 蚯蚓样品中丁氟螨酯的提取及检测

取染毒处理后的蚯蚓样品5 g，过夜吐泥后，放入50 mL 离心管中，加入25 mL 乙腈，用高速组织捣碎机匀浆30 s；加入2 g 氯化钠、2 g 硫酸钠和10 mL 去离子水，于300 r/min 下振荡30 min 后，于4500 r/min 下离心15 min；取上清液，过无水硫酸钠后转移至梨形蒸发瓶；反复提取3 次。收集全部提取液，旋转蒸发至1 mL，加入1 mL 正己烷进行分层萃取；同样步骤进行3 次。取上清液，于40℃下旋转蒸发至近干，用正己烷定容至1 mL，过0.22 μm 滤膜，待NP-HPLC 测定。

检测对映体拆分的手性分离柱选用AY-H柱，流动相为V(正己烷) :V(异丙醇)=97 : 3 溶液，柱流量为0.8 mL/min，进样量为10 μL。每个样品3 次重复。

1.4 添加回收试验

向蚯蚓空白样品中添加0.5、5 和10 mg/kg 3 个水平的丁氟螨酯标准溶液，每个水平重复5 次。采用1.3 节方法进行样品前处理，采用NPHPLC 系统进行检测，计算平均添加回收率和相对标准偏差 (RSD)。根据一级反应动力学拟合效果、添加回收率、检出限验证该方法的可行性[3]。

1.5 CYF 暴露后蚯蚓体重检测

挑选体重为 (0.5 ± 0.1) g 的蚯蚓，分别放入CYF 质量浓度为0.5、5 和10 mg/L 的人工土壤中，记录各浓度暴露下蚯蚓的体重变化。选择7条蚯蚓，记录其初始体重 (W0)，分别在暴露4、7、14、21 和28 d 后记录蚯蚓体重 (Wd)，根据公式 (2) 计算体重的变化率(R)。暴露结束后，用1 mm 网筛筛分各处理土壤，收集蚯蚓茧和蚯蚓幼体。每个处理重复3 次。

1.6 急性毒性试验

分别采用滤纸法和人工土壤法两种方法进行。

1.6.1 滤纸法 根据OECD 标准[7]，在直径3 cm、高8 cm 的圆底玻璃管中铺好滤纸并确保没有重叠，分别加入1 mL 用正己烷配制的质量浓度为50、100、150、200、300、500、700 和1000 mg/L的丁氟螨酯消旋体和对映体标准溶液，待正己烷完全挥发后，用1 mL 无菌水均匀润湿滤纸，放入一条已清肠的蚯蚓，确保蚯蚓可以接触到湿润的滤纸，每组10 次重复。以只加1 mL 正己烷和1 mL无菌水的处理为空白对照。将玻璃管封口并保持透气，于18℃、相对湿度80%条件下培养48 h，观察蚯蚓死亡情况。

根据Marking 相加指数法[8]，按公式 (3)～(5)评价两个对映体对蚯蚓的联合毒性。

式中，S为两个对映体的相加毒性之和，An(Bn) 为消旋体的LC50值；Aj和Bj分别是单一对映体的LC50值；AI 为联合毒性指数。

根据AI 值的大小判断药物的毒性类型：−0.2

1.6.2 人工土壤法 根据OECD 标准[7]，将500 g干燥人工土与丁氟螨酯标准溶液混匀，使丁氟螨酯在土壤中的最终质量浓度分别为150、200、300、500、700 和1000 mg/L，保持持水量在40%，分装于烧杯中，每个处理10 条蚯蚓，3 次重复。封口后于18℃、相对湿度80% 条件下培养14 d，观察死亡情况。

1.7 数据分析

采用SPSS 软件单因素方差one-way ANOVA分析处理组和对照组之间的差异显著性 (P<0.05)，用Origin 软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 添加回收率及相对标准偏差

由表1 可知：在0.5、5 和10 mg/kg 3 个添加水平下，丁氟螨酯在蚯蚓中的回收率在84%～88%之间，相对标准偏差 (RSD) 在1.3%～3.1%之间。各对映体的降解曲线符合一级降解动力学方程，线性拟合数据的R2均在0.97～0.98 之间。各对映体在蚯蚓中的定量限 (LOQ) 均为0.3 mg/kg。回收率及RSD 可满足农药残留分析的要求[3]，说明该提取方法适用于蚯蚓中丁氟螨酯的提取。

表1 丁氟螨酯对映体在蚯蚓中的添加回收率与相对标准偏差Table 1 Recoveries and relative deviation detection of each enantiomer of cyflumetofen in earthworms

2.2 丁氟螨酯对映体在蚯蚓体内的富集行为

结果 (图1) 表明：随着CYF 暴露时间的增加，各对映体在蚯蚓中的富集浓度均不断增加。前4 d 蚯蚓富集 (−)-CYF 的能力较强，第7 天其浓度达到最高点；7 d 后，蚯蚓体内 (+)-CYF 的浓度一直高于 (−)-CYF。BSAF 值测定结果也表明，(+)-CYF 和 (−)-CYF 在生物-土壤富集过程中存在选择性行为 (表2)。第7 天后， (+)-CYF 处理组的BSAF 值持续高于 (−)-CYF 处理组，表明蚯蚓富集 (+)-CYF 的能力更强。

表2 土壤中丁氟螨酯对映体 (5 mg/kg) 暴露不同时间后在蚯蚓体内的BSAF 值Table 2 BSAF value of CYF enantiomers (5 mg/kg) in earthworms during the enrichment process

图1 丁氟螨酯对映体经土壤暴露后在蚯蚓体内的富集曲线Fig. 1 Enrichment curve of CYF enantiomers in earthworms after exposure to soil

2.3 丁氟螨酯对蚯蚓体重的影响

经丁氟螨酯系列梯度浓度处理后，蚯蚓体重较对照组均显著减少，28 d 时高浓度处理组较低浓度处理组减重程度更大，表明存在剂量效应 (图2)。经过不同时间的监测观察，除14 d 时对照组中出现4 个蚯蚓茧外，其余各处理各个时间段均未发现蚯蚓茧和幼体。

图2 经不同浓度丁氟螨酯处理后蚯蚓体重的变化Fig. 2 Changes of the earthworm weight treated with different concentrations of CYF

2.4 急性毒性试验结果

丁氟螨酯消旋体及其对映体对蚯蚓的急性毒性结果如表3 所示。滤纸法中，CYF 消旋体对蚯蚓的LC50值低于各对映体的。根据联合毒性分析，计算得到S值为1.03，AI 值为 −0.03，介于−0.2

表3 丁氟螨酯消旋体及对映体对蚯蚓的急性毒性Table 3 Acute toxicity test results of the Rac-CYF and enantiomers to earthworms

3 结论与讨论

丁氟螨酯因其卓越的杀螨效果而被广泛使用，但近年来其对环境的影响已逐渐受到关注。据文献报道，丁氟螨酯对映体不仅在细胞层面对人的肝细胞具有毒性[2]，对斑马鱼胚胎具有选择性毒性[9]，而且对环境微生态中的微生物种群和氮循环功能也会造成负面影响[3]。本研究以土壤生态系统中的非靶标生物蚯蚓为对象进行了毒理学研究。首先，成功建立了丁氟螨酯在蚯蚓体内的检测方法。手性农药在不同处理下的生物-土壤富集是具有对映体选择性的，且其选择性可能受不同暴露条件的影响 (如氟虫腈)[10]。另外，通过比较BSAF 值也得到了 (+)-CYF 相比 (−)-CYF 在蚯蚓体内富集能力更强的结论。说明手性农药不但在生物活性上表现出显著性差异，而且其对映体在非靶标蚯蚓中的富集能力也不一致。对暴露于不同浓度丁氟螨酯中的蚯蚓体重检测发现，随浓度增加，蚯蚓减重程度更大，由此猜测施用手性杀螨剂丁氟螨酯会使蚯蚓体内相关的代谢功能紊乱，可能抑制蚯蚓体内营养物质生成，进而延缓蚯蚓的生长发育。丁氟螨酯在蚯蚓体内高浓度累积会造成其体重严重减少，而体重的减少可能与能量储备的减少有关，包括糖原、脂质和蛋白质含量的消耗[11]。根据丁氟螨酯对蚯蚓的急性毒性LC50值发现，单一使用一种丁氟螨酯对映体 (−)-CYF对蚯蚓的毒性会小于直接使用丁氟螨酯消旋体的毒性。因此，合理使用手性杀螨剂丁氟螨酯尤为重要。本研究中，通过对丁氟螨酯在非靶标生物蚯蚓的有关急性毒性、生物-土壤富集以及体重方面进行研究，为丁氟螨酯对映体的使用及相关环境风险评估提供了理论依据。