气相色谱-串联质谱法测定葡萄中78 种农药残留的定量校准方法评估

余 巍, 桂英爱, 毛希琴, 李海燕, 张敬波

(大连市检验检测认证技术服务中心，辽宁 大连 116630)

开展农产品中的农药残留分析及相应的监管是保障消费者食品安全的重要手段，受到各国政府及公众的广泛关注。为此，中国制定了严格的农药残留限量标准[1]，相应地，为满足残留检测需求，各种各样的技术和方法被开发出来。在常规分析实验室，农药残留分析往往要面对多种复杂基质和性质各异的化合物，给农产品农药残留监测带来了极大的挑战。

QuEChERS 样品前处理方法快速、简便、高效[2]，已成为农产品中农药残留的快速检测技术。同时，结合气相色谱-质谱联用法 (GC-MS)[3]、液相色谱-质谱联用法 (LC-MS)[4-6]以及高分辨质谱法 (HRMS)[7-9]等技术，其适用性和可靠性均得到了广泛的证实。在气相色谱进样过程中，共提取基质成分会减少色谱系统活性位点与目标待测物作用的机会，产生基质效应，并且往往导致基质效应增强[10-11]，因此，在定量时，减少基质效应的影响是必须考虑的问题。减少基质效应的方法通常有基质净化去除法[12]、标准添加法[13]、同位素内标法[14-15]和基质匹配曲线法[7，9]等。其中，基质净化去除法通常在针对某一类目标化合物时应用优势较大，但用于农药多残留检测则存在耗时长、待测化合物损失多和样品污染等问题；标准添加法有一定局限性且较少应用于日常检测；同位素内标法会增加检测成本。基质匹配校准法是目前应用最为广泛且可靠的方法，能有效减少基质效应和提升方法准确度。基质匹配校准法通常有两种方式：一种是取不含待测物的空白基质样品，经过与样品前处理相同的方法制得空白基质溶液，并用其稀释标准储备液来进行标准工作溶液配制；另一种是在空白基质样品中加入不同浓度的标准溶液，经过与样品相同的前处理，再通过以样品中待测物的质量浓度为横坐标、以其响应值为纵坐标建立的校准曲线来进行定量。许多文献往往采用其中的一种方式，尚未见将两种定量方法进行比较的研究报道。鉴于此，本研究采用QuEChERS 前处理方法和GC-MS/MS 相结合、一次进样测定葡萄中78 种农药残留的分析方法，来评估4 种基质匹配曲线校准方法的优劣，以期为日常实验室中的农药多残留检测提供应用参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

7890B-7010B 气相色谱-串联质谱联用仪，配电子轰击离子源 (EI) 和 Agilent MassHunter 工作站，美国Agilent 公司；XS 204 型分析天平，瑞士Mettler Toledo 公司；3-16L 离心机，德国Sigma公司；N-EVAP 112 型氮吹仪，美国Organomation公司；HS 501 型机械振荡器，德国IKA 公司。

外环氧七氯 (1000 mg/L)，购自德国Dr. Ehrenstorfer 公司，其他农药标准品 (100 mg/L) 均购自农业部环境保护科研监测所；QuEChERS 前处理方法提取包(含4 g 硫酸镁、1 g 氯化钠、1 g 柠檬酸钠、0.5 g 柠檬酸氢二钠) 和QuEChERS 前处理方法净化包(含900 mg 硫酸镁及150 mg PSA)，购自美国Agilent 公司；乙腈、乙酸乙酯和丙酮均为色谱纯，购自美国Tedia 公司。样品购自本地市场。

标准储备溶液的配制：取除外环氧七氯外的农药标准品各1 mL，混合，浓缩至近干；用2 mL 乙酸乙酯复溶，配制成50 mg/L 的混合标准储备液。外环氧七氯用乙酸乙酯稀释成10 mg/L的内标工作溶液。

1.2 样品前处理

称取样品10 g (精确至0.01 g) 于50 mL 离心管中，加入100 μL 10 mg/L 外环氧七氯内标工作溶液和10 mL 乙腈，混合均匀后加入QuEChERS 提取包，振荡提取30 min 后于4000 r/min 下离心5 min；取6 mL 上清液，置于装有QuEChERS 净化包的15 mL 离心管中，涡旋混合1 min 后于4000 r/min 下离心1 min；取1 mL 上清液氮吹至近干，用1 mL乙酸乙酯复溶，过0.22 μm 滤膜，待测定。

1.3 基质匹配标准工作溶液的配制

1.3.1 空白基质溶液配制 称取空白葡萄样品10 g(精确至0.01 g)，按1.2 节的步骤进行前处理，获得空白基质溶液。取1 mL 空白基质溶液氮吹至近干，用1 mL 配制好的系列混合标准溶液 (0.005、0.01、0.02、0.05 和0.1 mg/L，内标均为0.1 mg/L) 复溶后过0.22 μm 滤膜，待测定。该溶液中每毫升含1 g葡萄基质，定量分析时分别采用内标法和外标法。

1.3.2 基质匹配标准溶液配制 称取空白葡萄样品10 g (精确至0.01 g)，置于50 mL 离心管中，分别加入适量混合标准溶液，同时加入内标工作溶液100 μL，配制成0.005、0.01、0.02、0.05 和0.1 mg/kg内标含量为0.1 mg/kg 的空白添加基质样品，经过同1.2 节的前处理制备得到一系列基质匹配标准溶液。定量分析时分别采用内标法和外标法。

1.4 仪器分析条件

色谱条件：HP-5ms UI 石英毛细管色谱柱(30 m × 0.25 mm，0.25 μm)；载气为氦气；进样口温度240 ℃。程序升温：初始温度60 ℃，保持1 min；然后以40 ℃/min 的速率升至120 ℃；再以5 ℃/min 的速率升至310 ℃。柱流量1.04 mL/min；进样量1 μL；不分流进样。

质谱条件：EI 离子源；离子源温度280 ℃；传输线温度280 ℃；离子电压70 eV；动态多反应监测 (dMRM) 模式；溶剂延迟2 min。各农药优化后的仪器采集参数见表1。

表1 78 种农药的保留时间、定量离子对、定性离子对和碰撞电压Table 1 Retention time, quantifier mass transition, qualifier mass transition, collision energies of the 78 pesticides

续表1Table 1 (Continued)

续表1Table 1 (Continued)

2 结果与讨论

2.1 分析方法的选择

QuEChERS 方法被提出后，分别衍生出了针对酸碱敏感农药的乙酸缓冲盐提取体系，以及较弱酸性的柠檬酸缓冲盐提取体系，前者形成了美国官方分析方法AOAC 2007. 01，后者形成了欧盟官方分析方法EN 15662，中国也于2018 年发布了结合以上两种方法的食品安全国家标准GB 23200.113[16]。以上方法在各种基质中、针对大量不同性质的农药残留分析均取得了满意的分析结果[17]，已经有成熟的可以借鉴的分析流程。因此，本研究遵循EN 15662 的方法，采用商品化的提取和净化试剂包，以减少试验过程中人为产生的误差，方法仅在内标选择和进样溶剂选择上参照了国家标准GB 23200.113，即进样溶剂由乙腈置换成了乙酸乙酯，内标则选择外环氧七氯。进样溶剂置换是因为乙酸乙酯比乙腈更适合气相色谱进样，且比乙腈有更稳定的回收率和重现性[17]。

2.2 仪器条件的优化

通过对混合标准溶液的全扫描，借助美国国家标准与技术研究院 (NIST) 标准库匹配检索得到待测物的保留时间和特征碎片离子，优化碰撞能量，选择合适的定量和定性离子对，采用动态多反应监测模式 (dMRM) 进行定量。为了保证定量准确性和减少干扰，78 种农药和1 种内标的采集时间经过优化后，最低驻留时间确定为16 ms，避免了因采集点过少、峰形差导致的定量偏差。保留时间通过前期确定后，限定在前后0.2 min 范围内进行采集。同时，对于部分由同分异构体构成的农药混合物，采用分别积分后，再进行响应加和的方式定量，如氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氟氰菊酯等。葡萄中78 种农药在dMRM 模式扫描下的总离子流图见图1。

图1 78 种农药动态多反应监测总离子流色谱图(0.01 mg/kg)Fig. 1 Total ions chromatograms of dMRM of 78 pesticides (0.01 mg/kg)

2.3 定量校准方法的选择

EN 15662 方法和GB 23200.113 方法均采用基质匹配校准法参与定量，两者的差异主要是内标加入阶段不同，而这种差异会造成定量结果差异：EN 15662 方法在称样时加入内标，内标同待测物一起经历前处理过程，在一定程度上会补偿基质效应和回收率对结果的影响；而GB 23200.113 方法在进样前才加入内标，待测物能得到一定的基质效应补偿，但回收率得不到补偿。需要注意的是，由于内标不可能与所有分析对象有着相同的基质效应和回收率，这种差异会导致内标引起的补偿不匹配，造成结果偏离[17]，因此外标法也应该被考量。因此，本研究制定了图2 所示的4 种定量校准方法，就4 种方法在实验室日常检测准确性方面进行了方法学评价。

图2 4 种定量校准方法流程图Fig. 2 Scheme for the four selected calibration methods for quantification

2.4 方法学评价

2.4.1 标准溶液线性关系及定量限 根据国际食品法典委员会颁布的《CXG 90—2017 食品和饲料中农药残留测定分析方法的性能标准指南》中的要求，在低浓度测定 (μg/kg 级别)时，建议采用加权线性回归或者二次拟合函数，普通线性回归的结果误差较大[18-19]。这是由于曲线中农药浓度较高的点往往具有更大的权重，其产生的异方差导致普通最小二乘法不再是最合适的回归模型。因此，本研究中4 种标准曲线的绘制均采用二次拟合函数，线性相关系数均大于0.99。目前国内外法规的残留限量要求中，农药在水果中的定量限通常不低于0.01 mg/kg，故选择样品中添加水平为0.01 mg/kg，得到的待测物信噪比均大于10，满足定量限要求。

2.4.2 准确度与精密度 向葡萄中添加0.01 mg/kg的78 种农药，按照1.2 节处理，每个水平重复6 次。经4 种校准方法定量，78 种目标化合物的平均回收率分别为81%～110% (校准方法1)，82% ～114% (校准方法2)，56% ～ 95% (校准方法3) 和47% ～87% (校准方法4)。平均回收率低于60%的数据包括：校准方法3 中的氟胺氰菊酯，校准方法4 中的四氯硝基苯、硫环磷、亚胺硫磷、蝇毒磷、氯氰菊酯和氟胺氰菊酯。由于上述农药回收率过低，相应的数据已经失去了用于精密度统计的价值。除上述农药外，4 种校准方法中其他农药的相对标准偏差(RSD)均在20%以内，由图3 可知，校准方法1 和2 的回收率普遍要高于校准方法3 和4 的，同时校准方法1 采用内标法进行校准后，定量结果相对于校准方法2 更接近真值。而校准方法3 和4 的定量结果在未经回收率校准的情况下明显偏低。根据中国GB/T 27404 中实验室质量控制规范的要求，当添加水平为0.01 mg/kg时，回收率范围为60%～120%，RSD 小于21%[20]。78 种农药在校准方法1 和2 中的回收率和精密度均满足要求。

图3 78 种农药在4 种定量校准方法下的回收率Fig. 3 Recoveries of 78 pesticides using four calibration methods for quantification

由图3 可知，对于大多数农药来说，同是内标法的校准方法1 和3，以及同是外标法的校准方法2 和4，其回收率均有一定差值，说明在样品前处理初期加入标准物质后，在前处理过程中产生的损失已经体现在校准方法1 和2 的校准曲线中，最后的校准结果等同于经过回收率校正的结果。理论上，校准方法3 和4 通过回收率校正依然能够获得接近真值的结果，但在实际样品测试中，当方法满足回收率和精密度的要求时，回收率校正是不必要的[21]。因此，在本研究的实例中，使用校准方法3 和4 得到的结果与真值有一定偏离，在判定检出限或定量限等方面，直接测得的结果容易导致假阴性。并且，在校准方法3 和4 中，个别农药的回收率低于60%，已经不能满足检测需求了，如果不改变校准方法，这部分农药需要通过改变前处理方法或进样方法进行检测，才能获得满意的检测结果。

在方法回收率偏低的情况下，采用基质匹配标准溶液校准的结果更理想。这是由于目标化合物添加在空白基质样品中经历了同样品一样的前处理过程，待测物的损失和受基质影响同样品一致，表现在定量结果上得以补偿。需要注意的是，采用内标法校准时，与内标物性质差异较大的化合物的定量结果也将产生偏差[11]，如速灭磷、四氯硝基苯和乐果采用校准方法1 所得的回收率低于校准方法2，此情况下可以选择加入更合适的内标物对其进行单独校准，比如相应的同位素内标物。同时，还需注意基质差异，尽可能选择理化性质相同或相近的基质，避免因基质效应导致定量结果差异。

3 结论

由于食品中农药多残留分析需要考虑所有待测化合物的结构和理化性质以及基质的差异，因此选择合适的定量方法以获得更准确的数据尤为重要。日常农药多残留检测往往不具备对单一农药或单一基质进行有针对性检测的条件，因此在痕量浓度上提高检测准确度，才能避免假阳性或假阴性的结果。从本研究结果可以看出，采用基质匹配标准溶液校准法能够有效补偿样品分析过程中产生的基质效应和回收率差异，运用目前已有的成熟方法，结合GC-MS/MS 在一次进样中即可完成葡萄中78 种农药的分析，获得满意的结果，适合作为实验室日常分析的定量方法进行推广。