粪菌移植对坏死性小肠结肠炎新生小鼠肠道菌Th1/Th2细胞因子表达的影响①

田亚丽 王芳 田东惠 周逢强

（滨州市人民医院，滨州 256610）

新生儿坏死性小肠结肠炎（neonatal necrotizing enterocolitis，NEC）为临床新生儿尤其是早产儿较为常见且严重的肠道炎症疾病，主要表现为血便、腹胀及肠壁积气等症状，其致病机制尚未完全明确［1］。近年研究表明，NEC发生与肠道菌群紊乱密切相关，早产儿肠道菌落种类和数量减少，尤其是益生菌减少，导致克雷伯菌属处于相对优势，可能是NEC发病机制中的重要因素［2-3］。粪菌移植（fecal microbiota transplantation，FMT）对复发性难辨梭菌芽孢杆菌性肠炎（clostfidium difficile infection，CDI）患者及溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）小鼠治疗均有显著疗效，FMT预防及治疗能够显著改善结肠炎引起的肠道菌群及炎症因子改变，从而促进结肠黏膜修复［4-5］。因此，FMT是增加结肠炎患者肠道有益菌、改变肠道菌群结构紊乱、重建肠道内环境最直接的方式。为探讨FMT对NEC的预防作用，本研究将建立NEC新生小鼠模型，探讨FMT对NEC新生小鼠肠道菌群的影响，并分析具体机制，以期为NEC临床治疗提供新的方案。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物48只SPF级3日龄C57BL/6新生雌性小鼠，体质量1.5~3.0 g，购于山东省实验动物中心，许可证号：SCXK（鲁）2018-0012。

1.1.2 药品与试剂雅培婴幼儿奶粉购自美国雅培公司；HE染色试剂盒购自北京索莱宝公司；兔抗鼠Gata-3、T-bet抗体购自武汉博士德公司；小鼠IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α ELISA试剂盒购自美国R&D公司。

1.1.3 仪器CX-31显微镜购自日本Olympus公司产品；ELX-800酶标仪购自美国Bio-Tek公司。

1.2 方法

1.2.1 分组及建模48只C57BL/6新生小鼠置于保育箱，（36±1）℃，45%~60%相对湿度，经口插入PICC管，灌胃给予代乳品，每4 h喂养1次，0.03~0.05 ml/（g·次）。适应性喂养7 d，随机分为对照组、NEC模型组、FMT预防组、FMT治疗组，每组12只。除对照组外，其余三组均参照文献［6］采用缺氧+冷刺激+人工喂养法连续刺激3 d建立NEC模型：新生小鼠放入自制密闭缺氧箱（100%N2）90 s，4℃冷刺激10 min，缺氧、冷刺激2 d/次，交叉进行。对照组幼鼠自由饮水6 d；FMT预防组在建立NEC模型同时灌胃给予FMT，饮水恢复3 d；FMT治疗组建模成功后灌胃给予FMT，连续3 d。

1.2.2 FMT菌液制备实验期间每日收集对照组小鼠3 h内新鲜粪便，混匀，称重，加入生理盐水制成400 mg/ml FMT混悬液，随后按小鼠自身体质量1/500剂量给予FMT预防组及FMT治疗组（80~120µl/只），同时实验期间每天收集各组小鼠粪便，制备FMT菌液，-80℃保存用于菌群分析。

1.2.3 结肠组织病理学观察实验第7天处死各组小鼠，取出肠管（十二指肠下端至回盲部），于白色无菌纱布上肉眼观察肠管是否有出血、坏死或无肠腔积气等NEC样病变。清除肠道内容物，取各组幼鼠肠组织（近回盲部1~2 cm），4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，HE染色，封片，光学显微镜下观察肠组织病理学变化。

1.2.4 ELISA测定结肠组织细胞因子水平准确称取各组小鼠结肠组织，参考文献［7］制备结肠组织匀浆，加入预冷PBS缓冲液并超声粉碎，4℃、3 000 g离心15 min，取上清，检测炎症因子含量，严格按照IL-4、IL-10、TNF-α及IFN-γ ELISA试剂盒说明书操作。

1.2.5 免疫组化检测结肠组织Gata-3和T-bet阳性细胞表达参考文献［8］SP法检测各组小鼠结肠组织Gata-3和T-bet阳性因子表达，加入一抗Gata-3（1∶100）、T-bet（1∶50）4℃孵育过夜，加入二抗室温孵育。已知阳性片为阳性对照，PBS缓冲液代替一抗为阴性对照，细胞核或细胞质中出现黄色或棕黄色颗粒为阳性细胞。每张片随机选取3个无交叉视野，Olym-pusBX41显微镜拍照，Image-pro Plus 6.0图像分析软件计算阳性细胞比例。

1.2.6 小鼠肠道菌群分析收集各组小鼠实验期间粪便制备FMT菌液，-80℃保存。参考文献［9］采用Illumina miseq platform测序平台（Illumina公司）对实验样本进行小鼠粪便菌群测序（16 S rDNA），聚类分析和PCA分析等方法分析样本属水平上的菌群结构与数量。

1.3统计学分析采用SPSS20.0软件进行统计学分析，计量资料采用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组新生小鼠体质量变化及生存情况建模前4组新生小鼠体质量差异无统计学意义（P>0.05）。建模结束时，模型组及FMT干预组小鼠体质量差异无统计学意义（P>0.05），但较正常对照组明显降低（P<0.05）。正常对照组小鼠进食和排便均正常，精神状态良好，未出现NEC症状，而模型组及FMT干预组均出现不同程度胃潴留、腹胀、活动减少等症状，模型组均出现黑便、血便等症状。建模7 d，FMT预防组和FMT治疗组体质量差异无统计学意义，但较模型组明显升高（P<0.05，表1）。

表1 各组小鼠体质量及生存率比较（±s）Tab.1 Comparison of body weight and survival rate of mice in each group（±s）

表1 各组小鼠体质量及生存率比较（±s）Tab.1 Comparison of body weight and survival rate of mice in each group（±s）

Note：Compared with Control，1）P<0.05；compared with NEC model，2）P<0.05.

Groups Control NEC model FMT prevention FMT treatment Body weight/g 0 d 6.22±0.65 6.17±0.43 6.23±0.94 6.15±0.76 3 d 7.24±1.21 5.65±0.451）5.76±0.611）5.81±0.661）7 d 8.15±0.84 5.14±0.381）6.43±0.491）2）6.39±0.511）2）Survival rate/%100 66.7 83.3 83.3

2.2 各组新生小鼠结肠组织形态及病理学改变正常对照组小鼠肠组织肠管色泽鲜嫩，弹性佳，呈淡黄色，无出血、积气和水肿等；NEC模型组小鼠肠管呈黑红色改变，弹性差，肠管有出血现象，明显扩张有积气，呈串珠样改变；FMT预防组和FMT治疗组小鼠肠组织均呈浅红色，弹性尚可，肠管有轻度积气及轻微出血现象（图1）。HE染色病理学观察显示：对照组回肠部结构完整，隐窝结构规则，腺体排列规则，组织结构清楚，无炎症细胞浸润及溃疡；NEC模型组回肠部隐窝数扭曲，融合减少，绒毛脱落消失，且有大量炎症细胞浸润；FMT预防组和FMT治疗组小鼠结肠炎症均明显缓解，隐窝数增加，上皮较为完整，结肠黏膜呈愈合趋势（图2）。

图1 各组新生小鼠肠管形态及结肠组织病理学变化（×200）Fig.1 General morphology of intestines and histopatho⁃logical changes in colon of newborn mice in each group（×200）

2.3 各组新生小鼠结肠组织细胞因子测定与对照组相比，NEC模型组及FMT预防、治疗组细胞因子IL-4及IL-10水平明显降低（P<0.05），TNF-α及IFN-γ水平明显升高（P<0.05）。与NEC模型组相比，FMT预防组及治疗组IL-4及IL-10水平明显提高（P<0.05），TNF-α及IFN-γ水平明显降低（P<0.05，图2）。

图2 各组小鼠结肠组织各细胞因子含量比较Fig.2 Comparison of cytokine content in colon tissue of mice in each group

2.4 各组新生小鼠结肠组织Gata-3和T-bet阳性细胞表达正常对照组小鼠结肠组织Gata-3和T-bet阳性细胞仅存在于黏膜上皮，固有层细胞存在少量浸润，NEC模型组、FMT预防组、FMT治疗组阳性细胞均不同程度增加，且浸润明显。与对照组相比，NEC模型组T-bet阳性细胞比例及T-bet/Gata-3明显提高（P<0.05），Gata-3阳性细胞比例明显降低（P<0.05）。与NEC模型组相比，FMT预防组及治疗组T-bet阳性细胞比例及T-bet/Gata-3明显降低（P<0.05），Gata-3阳性细胞比例明显提高（P<0.05，图3、表3）。

表3 各组小鼠结肠组织Gata-3和T-bet阳性细胞占比（±s）Tab.3 Proportion of Gata-3 and T-bet positive cells in colon tissue of mice in each group（±s）

表3 各组小鼠结肠组织Gata-3和T-bet阳性细胞占比（±s）Tab.3 Proportion of Gata-3 and T-bet positive cells in colon tissue of mice in each group（±s）

Note：Compared with Control，1）P<0.05；compared with NEC model，2）P<0.05.

Groups Control NEC model FMT prevention FMT treatment T-bet/%12.25±4.78 65.65±9.461）42.68±5.891）2）33.78±4.271）2）Gata-3/%33.35±6.68 10.54±2.321）18.39±4.481）2）22.78±5.711）2）T-bet/Gata-3 0.36±0.01 6.76±0.231）2.37±0.071）2）1.58±0.031）2）

图3 各组新生小鼠结肠组织Gata-3和T-bet阳性细胞（×400）Fig.3 Gata-3 and T-bet positive cells in colon tissue of newborn mice in each group（×400）

2.5 各组新生小鼠肠道菌群分析NEC模型组小鼠乳杆菌属明显减少，拟杆菌属和颤螺菌属增加，建模7 d时，颤螺菌属连续增加，拟杆菌属含量下降，乳杆菌属未见明显改变。FMT预防组在建立NEC模型时菌群改变与NEC模型组变化趋势相同，但建模7 d时拟杆菌属及颤螺菌属有所减少，Allo⁃baculum菌属及乳杆菌属占比有所提高。FMT治疗组颤螺菌属及拟杆菌属降幅明显，乳杆菌属出现更明显增加趋势（图4）。

图4 各组新生小鼠建模前后肠道菌群分析Fig.4 Analysis of intestinal flora of each group of new⁃born mice before and after modeling

3 讨论

NEC为新生儿常见危重症，发病机制复杂，可能与新生儿肠道功能不全、肠黏膜功能受损及感染有关［10］。正常肠道黏膜屏障可有效防止多种有害物质穿过肠黏膜进入人体及血液，从而防止结肠炎的发生［11］。研究显示，FMT对于调节结肠炎患者肠道菌群平衡、重建肠道微生态系统及恢复肠黏膜屏障有明显疗效，但对于新生儿NEC的治疗未见报道［12］。本研究中结果显示，NEC模型组小鼠一般生存情况、体质量和肠道大体形态、回盲肠组织病理学损伤等方面均明显差于对照组，表明本研究模型建立成功。FMT干预组或FMT治疗组均能明显改善NEC诱导的体质量下降，两组小鼠的一般生存情况良好，肠道大体形态及肠组织病理学损伤较轻微，表明FMT在NEC小鼠动物模型中具有明显保护作用。

肠道微生态激发的免疫应答在NEC的发展和转归中有重要作用，抑制免疫反应介导的肠黏膜损伤可促进肠黏膜屏障恢复［11］。正常状态下，肠道黏膜在Th1、Th2和Treg等不同CD4+T细胞亚群的协调下维持内环境稳态，结肠炎患者病变部位CD4+T细胞增殖和浸润增加，其中Th1/Th2细胞平衡紊乱为重要表现。转录因子T-bet和Gata-3转录因子分别特异性表达于Th1和Th2细胞，因此T-bet和Gata-3是判断Th1/Th2细胞增殖和浸润程度的良好指标［13-14］。本研究结果显示，正常对照组小鼠结肠组织的Th1/Th2平衡以Th2抗炎为主导，而NEC模型小鼠则以Th1促炎为主导。FMT预防或治疗后T-bet阳性细胞浸润明显降低，Gata-3阳性细胞明显增加，且以Th1细胞分泌为主的TNF-α、IFN-γ等促炎因子明显减少，以Th2细胞分泌为主的IL-4、IL-10等抗炎因子明显增加，且FMT治疗组的效果优于FMT预防组。以上研究表明FMT干预可调节Th1/Th2平衡右移介导肠黏膜修复，改善肠道微生态环境。

肠道菌群平衡对维持小鼠肠黏膜免疫屏障功能具有重要作用，若肠道菌群失调便可激活肠道内多种免疫细胞，释放大量炎症介质因子，因此FMT干预对NEC抗炎和肠道黏膜修复作用与FMT调节肠道菌群平衡密不可分［15］。在本研究中，FMT治疗组新生小鼠拟杆菌属及乳杆菌属明显改变，产生短链脂肪酸的Allobaculum菌明显增加，颤螺菌属所占比例明显降低。增加的乳杆菌可通过竞争性抑制作用有效抑制致病菌过度繁殖，进而维持肠道微生态平衡，并调节新生小鼠胆汁酸盐活性影响脂质代谢，增加体质量，同时乳杆菌还可通过促进CD4+T细胞分泌IFN-γ和IL-2等抗炎因子进一步发挥抗炎作用［16-18］。短链脂肪酸对于维持结肠上皮细胞正常的形态和功能具有重要作用，人体肠道菌群中颤螺菌属的水平高低与体质量呈负相关［19］。因此FMT干预后颤螺菌属的减少可能与小鼠体质量增加有关。

因此，粪菌移植可有效调节NEC模型小鼠肠道菌群结构，减轻结肠炎症损害，促进肠黏膜屏障功能恢复，可能与FMT干预后调节Th1/Th2平衡，下调炎症因子表达，介导Th2免疫修复有关。