TIGIT分子在HBV免疫治疗中的作用探究①

卢杨 孙汭 田志刚 陈永艳（中国科学技术大学免疫学研究所，合肥 230027）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是全球性公共卫生问题，世界卫生组织数据显示2019年全球共有2.96亿慢性HBV感染者，由慢性HBV感染引起的肝硬化与肝细胞癌导致的死亡人数约82万［1］。中国目前约有8 600万HBV感染者，其中约3 000万为慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB），乙肝成为威胁人群公共健康的重要问题［2-3］。HBV诱导的免疫耐受是HBV感染慢性化的重要原因，多种机制参与了HBV免疫耐受形成过程，其中免疫抑制性受体介导的抑制信号发挥了重要作用［4］。

T细胞免疫球蛋白与ITIM结构域（T cell immu‑noglobulin and immune receptor tyrosine-based inhibi‑tory motif domain，TIGIT）分子是近些年新发现的免疫抑制性受体之一，表达于T细胞和NK细胞上，与其配体CD155或CD112结合后可以直接抑制CD8+T细胞或NK细胞的功能［5］。在人类肿瘤患者和小鼠肿瘤模型中，NK细胞和T细胞显著上调表达TIGIT分子，表现为功能耗竭，其抗肿瘤能力显著下降［6-7］。利用单克隆抗体阻断TIGIT信号可以有效恢复NK细胞和T细胞的效应功能，因此靶向TIGIT分子已成为肿瘤免疫治疗的研 究 热点［5，8］。除 此之外，TIGIT分子在HCV、HIV等慢性病毒感染患者的T细胞上高表达，导致抗病毒T细胞功能障碍进而无法有效清除病毒，抗体阻断TIGIT可以部分恢复抗病毒T细胞的功能，这为靶向TIGIT治疗慢性感染提供了依据［9-12］。

本实验室已有的研究证实HBsAg转基因小鼠的CD8+T细胞上TIGIT分子的表达水平显著高于野生型小鼠，TIGIT分子参与了机体对HBV适应性免疫耐受的维持［13］。但是，目前对于阻断TIGIT分子是否影响机体抗HBV的免疫应答尚无相关报道。本研究利用高压注射pAAV-HBV1.2质粒获得HBV携带小鼠，发现HBV携带小鼠其NK细胞和T细胞显著上调表达TIGIT分子，证实抗体阻断TIGIT信号或TIGIT基因缺陷均可加快机体对HBV的免疫排斥，为靶向TIGIT分子进行HBV免疫治疗提供了重要的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物4周龄SPF级野生型（WT）C57/BL6雄性小鼠和6周龄的雌性裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司；TIGIT转基因（TIGIT-Tg）小鼠由中国科学院生物物理所范祖森教授赠送；TIGIT分子缺陷（TIGIT-KO）小鼠由Bristol-Myers Squibb公司提供。所有小鼠均饲养在中国科学技术大学实验动物中心，饲养和繁育过程严格按照SPF级小鼠的饲养要求和条件进行，实验操作过程遵守中国科学技术大学实验动物管理条例。

1.1.2 实验试剂及仪器APC-CY7-CD45、BV605-NK1.1、FITC-CD11a、BV421-TNF-α、PE-IL-2、Percp-CY5.5-IFN-γ（Biolegend）；PE-CY7-TIGIT、BV660-TIGIT（eBioscience）；BUV395-CD3、BUV563-CD4、BUV737-CD8α（BD公司）；Percoll（GE Health）；血细胞分析用红细胞裂解液（北京同生时代生物技术有限公司）；HBsAg放射免疫法试剂盒（北京北方生物技术研究所）；质粒抽提试剂盒NucleoBond Xtra Midi EF kit（MACHEREY-NAGEL GmbH&Co.KG）；pAAV-HBV1.2质粒（台湾大学陈培哲教授赠送）；pAAV-null对照质粒（本实验室构建）；13G6抗体（TIGIT阻断性单克隆抗体，由本实验室制备纯化）；大鼠血清（巨石生物科技有限公司）；PMA、莫能霉素（Merck）；离子霉素（Sigma）；胞内细胞因子染色用固定液与穿膜液（Invitrogen）；胎牛血清（Gibco）；γ-射线计数仪（科大创新股份有限公司中佳分公司）。

1.2方法

1.2.1 HBV携带小鼠模型构建将6µg无内毒素的pAAV-HBV1.2质 粒或pAAV-null质粒用PBS稀释至1.8 ml，通过尾静脉高压注射（HDI），即在4~8 s内将其注射至5周龄雄性小鼠体内。

1.2.2 HBV携带小鼠的anti-TIGIT抗体干预在小鼠尾静脉高压注射质粒后2 d开始腹腔注射13G6抗体或者对照IgG，1次/周，每次200µg/只小鼠。

1.2.3 放射免疫法检测小鼠血清HBV表面抗原浓度用生理盐水稀释待测血清样品至200µl。将200µl待测样品和200µl标准品加入对应的HBsAg包被管中，45℃恒温水浴锅振荡孵育2 h。孵育结束后取出包被管，吸去样品或标准品，用纯水洗涤包被管3次。洗涤后吸尽管中液体，加入200µl125I标记的anti-HBs，室温孵育过夜。孵育结束后取出包被管，吸去标记液，用纯水洗涤包被管3次。洗涤后吸尽管中液体，用γ-射线计数仪检测CPM值。

1.2.4 小鼠肝脏单个核细胞分离放血后脱臼牺牲小鼠，取出肝脏浸泡于预冷的PBS中。将肝脏置于覆有200目筛网的10 cm培养皿上，加入PBS后研磨肝脏并将研磨液转移至50 ml离心管中。4℃、50 g离心1 min后弃去沉淀，将上清转移至另一50 ml离心管中，4℃、250 g离心10 min，弃上清。使用4 ml 40%percoll溶液重悬细胞，轻轻加至含3 ml 70%percoll溶液的15 ml离心管中，常温750 g离心30 min，离心机转速快升慢降。吸取白膜层细胞加入至PBS中充分混匀，4℃、400 g离心10 min，弃上清，加入PBS重悬细胞并计数。

1.2.5 流式细胞术检测细胞表面分子吸取1×106个肝脏单个核细胞于1.5 ml EP管中，加PBS至80µl。加入10µl大鼠血清封闭细胞表面Fc受体，4℃封闭30 min。加入10 µl稀释后流式荧光抗体混合液，4℃避光标记30 min。抗体孵育结束后，向EP管中加入1 ml PBS洗涤1次，4℃、500 g离心5 min，弃上清，沉淀用200µl PBS重悬，过200目滤网转移至流式管中，上机检测。

1.2.6 流式细胞术检测细胞内细胞因子用含有50 ng/ml PMA、1 µg/ml离子霉素和10 µg/ml莫能霉素的1640完全培养基（含有10%FBS）重悬单个核细胞，调整浓度至1×106个/ml，吸取1 ml至24孔板中，37℃、5%CO2培养4 h。培养结束后离心收集细胞于1.5 ml EP管中。同1.2.4进行细胞表面分子标记，在PBS洗涤后加入100 µl固定液重悬细胞，4℃避光条件下固定30 min。固定结束后加入1 ml穿膜液洗涤1次，500 g离心5 min，弃上清，用80µl穿膜液重悬细胞并加入10 µl大鼠血清，4℃避光封闭30 min后加入10µl稀释后的流式荧光抗体混合液，4℃避光标记1 h。抗体孵育结束后，向EP管中加入1 ml PBS洗涤1次，4℃、500 g离心5 min，弃上清，沉淀用200 µl PBS重悬，过200目滤网转移至流式管中，上机检测。

1.2.7 外周血单个核细胞分离与流式检测向100µl抗凝血液中加入1 ml红细胞裂解液，常温裂解10 min。300 g离心10 min后弃上清，加入1 ml PBS重悬细胞洗涤1次，300 g离心10 min后弃去上清，80µl PBS重悬细胞。同1.2.5中步骤对得到的单个核细胞进行抗体标记，上机检测。

1.3 统计学处理使用GraphPad prism 8.0进行数据统计分析，实验数据以±s表示，两两比较采用独立样本t检验，血清HBsAg浓度变化曲线比较采用Two-way ANOVA检验，血清HBsAg阳性率变化曲线采用Log-Rank检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HBV携带小鼠NK细胞和T细胞上调表达TIGIT分 子通 过HDI给 予5周龄WT小鼠6 µg pAAV-HBV1.2质粒或者pAAV-null对照质粒。在HDI后1~5周每周检测小鼠血清HBsAg浓度，同时检测其外周血NK细胞和T细胞上TIGIT分子的表达水平。结果显示，HDI pAAV-HBV1.2质粒的小鼠血清HBsAg水平在各时间点均显著增高（图1A），说明HDI质粒的方式可建立HBV携带小鼠模型。流式细胞术检测结果显示HDI pAAV-HBV1.2质粒的小鼠其外周血NK细胞和T细胞上TIGIT分子阳性率均显著高于pAAV-null对照组（图1B、C），提示HBV携带可上调NK细胞和T细胞表面TIGIT分子的表达水平。

图1 HDI pAAV-HBV1.2质粒促进小鼠外周血NK细胞和T细胞上调表达TIGIT分子Fig.1 HDI of pAAV-HBV1.2 plasmid up-regulates expression levels of TIGIT on peripheral NK cells and T cells

2.2 抗体阻断TIGIT分子显著降低HBV携带小鼠血清HBsAg水平进一步利用抗体阻断技术探究TIGIT分子在体内抗HBV免疫应答中发挥的作用。首先利用TIGIT-Tg小鼠腹腔注射13G6抗体后72 h采集小鼠外周血，使用流式细胞术检测其NK细胞和T细胞上TIGIT分子阳性率，结果显示注射13G6抗体后小鼠NK细胞和T细胞上TIGIT分子可被有效阻断（图2A、B）；且外周血中单个核细胞数量以及各细胞亚群比例无明显变化（图2C），证实13G6是TIGIT分子阻断性单克隆抗体。

图2 13G6抗体可有效阻断NK细胞和T细胞表面TIGIT分子Fig.2 13G6 mAb effectively blocks TIGIT on surface of NK cells and T cells

在小鼠HDI pAAV-HBV1.2质粒2 d后给予13G6抗体或对照IgG抗体干预。实验结果显示，给予13G6抗体干预后小鼠血清HBsAg浓度显著低于对照组小鼠（图3A），且血清HBsAg发生转阴的时间点提前，转阴率升高（图3B）。上述结果表明抗体阻断TIGIT分子可促进机体排斥HBV。

图3 13G6抗体阻断TIGIT显著降低HDI pAAV-HBV1.2质粒小鼠血清HBsAg水平Fig.3 Blocking TIGIT by 13G6 mAb significantly reduces serum levels of HBsAg in pAAV-HBV1.2 plasmid HDI mice

2.3 抗体阻断TIGIT分子增强小鼠肝脏NK细胞和T细胞抗HBV免疫应答为进一步阐明抗体阻断TIGIT分子促进机体排斥HBV的内在机制，小鼠经13G6抗体干预23周后分离其肝脏单个核细胞，利用流式细胞术分析其NK细胞和T细胞的表型与效应功能。结果显示，相比于IgG对照组小鼠，13G6抗体干预的小鼠肝脏中浸润了更多的NK细胞、CD4+T及CD8+T细胞，并且经历TCR信号刺激的抗原特异性CD8αloCD11ahiT细胞的数量亦显著增加（图4A）；肝脏内浸润的NK细胞、CD4+T细胞及CD8+T细胞分泌IFN-γ、TNF-α等细胞因子的能力显著增强（图4B）。

图4 13G6抗体阻断TIGIT分子后小鼠肝脏NK细胞和T细胞数量增加且分泌细胞因子功能增强Fig.4 Blocking TIGIT by 13G6 mAb increases number of intrahepatic NK cells and T cells and enhances their cytokine production

2.4 TIGIT分子缺失促进小鼠对HBV质粒的免疫排斥进一步利用TIGIT-KO小鼠验证TIGIT分子在机体抗HBV免疫应答中的作用。给予TIGIT-KO小鼠以及WT小鼠HDI pAAV-HBV1.2质粒并在HDI后不同时间点检测小鼠血清HBsAg浓度。实验结果显示，相比于WT小鼠，TIGIT-KO小鼠血清HBsAg浓度显著降低（图5），证实TIGIT分子的缺失增强机体排斥HBV的能力，导致血清HBsAg浓度降低。

图5 TIGIT-KO小鼠HDI pAAV-HBV1.2质粒后血清HBsAg水平显著低于WT小鼠Fig.5 Serum levels of HBsAg in TIGIT-KO mice after HDI of pAAV-HBV1.2 plasmid was significantly lower than that of WT mice

3 讨论

目前临床上常用核苷酸类似物（NA）以及IFN-α对CHB患者进行抗病毒治疗，但是抗病毒治疗仅能抑制病毒的复制、降低血清中HBV标志物水平，抗病毒免疫细胞功能并未完全恢复，停药后仍会发生病毒学复发［14-16］。因此，建立一种新的能够恢复机体抗HBV免疫应答能力的治疗方法至关重要。靶向免疫检查点的疗法能够阻断T细胞和NK细胞上的抑制性信号从而恢复其免疫监视功能，为治疗CHB提供了一个新的选择。已有研究发现HBV特异性T细胞显著上调表达包括TIGIT分子在内的多种免疫抑制性受体［17-18］，这为开发靶向TIGIT分子的免疫疗法奠定了基础。

目前靶向免疫检查点治疗CHB的研究显示，体外实验中阻断PD-1、CTLA-4、TIM-3和2B4可以恢复HBV特异性T细胞的功能，并且相比于其他受体，在体外试验中阻断PD-1的响应率最高［19］。一项Ⅰb期临床试验结果显示使用anti-PD-1抗体治疗HBeAg阴性的CHB患者，其副作用可控并且可以有效降低患者血清HBsAg水平［20］。本实验室先前的研究证实阻断NK细胞上的抑制性受体NKG2A也能够促进HBV小鼠模型中NK细胞和HBV患者外周血NK细胞的抗HBV功能，进而降低血清HBsAg滴度［21］。本研究发现HBV能够使小鼠NK细胞和T细胞上的TIGIT分子表达水平显著上调，使用抗体阻断TIGIT信号后能够同时增强T细胞和NK细胞的效应功能，显著降低血清HBsAg水平，促进机体排斥HBV。尽管已有研究证实靶向免疫检查点对HBV免疫治疗具有一定的效果，但是尚不足以实现机体完全清除HBV病毒。免疫检查点联合阻断或免疫检查点阻断与其他药物的联合使用值得进一步探究，以期获得更好的免疫治疗效果。