miR-543靶向HDAC3调控LPS诱导的气道上皮细胞损伤

孙智娜 何秀琴 拉毛卓玛

（青海红十字医院呼吸与危重症医学科，西宁 810000）

支气管哮喘是由多种炎症细胞、细胞组分参与形成的气道炎症性疾病。支气管上皮细胞作为重要的气道结构细胞，是维持呼吸道防御屏障的关键，当吸入刺激性异物时，支气管上皮细胞的结构受损，其自然保护功能受到破坏，引起感染和气道炎症，参与哮喘的发生、发展［1］。因此，如何有效的减轻气道上皮损伤对哮喘防治意义重大。miR-543是近年发现的人类疾病相关RNA，脊髓损伤大鼠模型中miR-543表达降低，过表达miR-543可降低脊髓损伤大鼠的炎症反应，抑制细胞凋亡［2］。过表达miR-543还可有效对抗IL-1β诱发的软骨细胞损伤［3］。生物信息学分析发现，组蛋白脱乙酰酶3（histone deacetylases 3，HDAC3）是miR-543的潜在靶点。既往研究显示，HDAC3在缺血性脑损伤小鼠的小胶质细胞中表达增加，抑制其表达可减轻缺血性脑损伤导致的炎症反应［4］。抑制HDAC3表达对糖尿病小鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用［5］。然而，miR-543和HDAC3在支气管哮喘疾病中对支气管细胞损伤的研究较少。本研究以脂多糖（lipopolysaccha‑ride，LPS）诱导人气道上皮细胞BEAS-2B损伤，探讨miR-543靶向HDAC3对BEAS-2B细胞凋亡、炎症损伤的影响，以期为支气管哮喘防治提供潜在靶点。

1 材料与方法

1.1 材料人气道上皮细胞株BEAS-2B购于中国科学院典型培养物保藏中心；RPMI1640培养液、胎牛血清购于美国Hyclone公司；LPS购于美国Sigma公司；miR-543模拟物（miR-543 mimics）及其阴性对照（miR-NC）、HDAC3小干扰RNA（si-HDAC3）及其阴性对照（si-NC）、miR-543抑制物（anti-miR-543）及其阴性 对 照（anti-miR-NC）、HDAC3过表达 质粒（pcDNA-HDAC3）、空载体质粒（pcDNA）、PCR引物由上海生工公司提供；Hairpin-it TM miRNA qPCR试剂盒购于上海吉玛制药技术有限公司；SYBR Green master mix购于北京索莱宝生物技术公司；IL-6、IL-1β和TNF-α ELISA试剂盒、鼠源HDAC3抗体、兔源B细胞淋巴瘤2（B cell lymphoma 2，Bcl-2）抗体、兔源Bcl相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗体、兔源磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde phos‑phate dehydrogenase，GAPDH）抗体、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗购于上海碧云天生物技术研究所。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和实验分组BEAS-2B细胞采用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基在37℃、5%CO2的培养箱中培养。对照组（Con）：用完全培养基培养细胞；LPS组：参照文献［6］用LPS终浓度为50µg/ml的RPMI1640培养基处理BEAS-2B细胞8 h；LPS+miR-NC组、LPS+miR-543组、LPS+si-NC组、LPS+si-HDAC3组、LPS+miR-543+pcDNA组、LPS+miR-543+pcDNA-HDAC3组为利用脂质体转染法将miR-NC、miR-543 mimics、si-NC、si-HDAC3、miR-543 mimics+pcDNA、miR-543 mimics+pcDNA-HDAC3分别转染至BEAS-2B细胞，随后用终浓度为50 µg/ml的RPMI1640培养基处理BEAS-2B细胞8 h。

1.2.2 RT-qPCR检 测miR-543和HDAC3 mRNA表达利用TRIzol试剂从各组BEAS-2B细胞中分离得到总RNA。用DU650分光光度计测定分离RNA的纯度和浓度。以U6为内参，用Hairpin-it TM miRNA qPCR试剂盒检测miR-543表达。以GAPDH为内参，SYBR Green qPCR法检测HDAC3 mRNA表达。2-ΔΔCt法进行数据处理。

1.2.3 ELISA试剂盒检测细胞培养液上清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平BEAS-2B细胞按照实验分组处理后，收集培养基上清，按照ELISA试剂盒说明书步骤测定IL-6、IL-1β和TNF-α浓度。酶标仪检测450 nm处的吸光度值。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡收集各组BEAS-2B细胞，调整为1×106个/ml的细胞悬液。取100 µl细胞悬液，按照Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒说明书检测BEAS-2B细胞凋亡率。

1.2.5 Western blot检测HDAC3、Bcl-2和Bax蛋白表达收集各组BEAS-2B细胞，细胞裂解液提取总蛋白。4℃、13 000 g离心20 min，BCA蛋白检测试剂盒测定上清中的蛋白浓度。取25µg蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白分离后将其转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶室温封闭膜1 h。加入一抗溶液4℃孵育过夜。用二抗溶液室温孵育膜1 h。洗膜后，用Syngene软件对印迹进行分析。

1.2.6 双荧光素酶报告实验将含有miR-543结合位点的野生型（WT）或含有miR-543结合位点突变序列的突变型（MUT）的3'UTR-HDAC3分别插入pmirGLO荧光素酶报告载体，分别命名为WTHDAC3、MUT-HDAC3，该步骤由北京华大基因有限公司完成。利用Lipofectamine 2000试剂将WT/MUTHDAC3分 别 与miR-543 mimics或miR-NC转 染 到BEAS-2B细胞，转染48 h使用双荧光素酶报告基因检测系统检测BEAS-2B细胞荧光素酶活性。

1.3 统计学分析每个实验组设置3个平行实验，重复3次。实验数据以±s表示。采用SPSS20.0软件进行统计分析，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，通过SNK-q法进行两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-543和HDAC3在LPS诱导的气道上皮细胞损伤中的表达与Con组比较，LPS组BEAS-2B细胞中miR-543表达显著降低，而HDAC3 mRNA和HDAC3蛋白表达显著升高（P<0.05）。见图1、表1。

表1 miR-543和HDAC3在LPS诱导的气道上皮细胞损伤中的表达（±s，n=9）Tab.1 Expressions of miR-543 and HDAC3 in LPS-in⁃duced airway epithelial cell injury（±s，n=9）

表1 miR-543和HDAC3在LPS诱导的气道上皮细胞损伤中的表达（±s，n=9）Tab.1 Expressions of miR-543 and HDAC3 in LPS-in⁃duced airway epithelial cell injury（±s，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P<0.05.

Groups Con LPS t P miR-543 1.00±0.07 0.55±0.051）16.693<0.01 HDAC3 mRNA 1.00±0.06 2.85±0.271）20.066<0.01 HDAC3 protein 0.39±0.03 0.78±0.061）17.441<0.01

图1 HDAC3蛋白表达Fig.1 HDAC3 protein expressions

2.2 miR-543过表达对LPS诱导的气道上皮细胞炎症因子表达的影响与Con组比较，LPS组BEAS-2B细胞中miR-543表达显著降低，培养液上清中IL-6、IL-1β、TNF-α表达显著升高，细胞凋亡率、Bax蛋白表达显著升高，Bcl-2蛋白表达显著降低；与LPS+miR-NC组 比 较，LPS+miR-543组BEAS-2B细 胞 中miR-543表达显著升高，培养液上清中IL-6、IL-1β、TNF-α表达显著降低，细胞凋亡率、Bax蛋白表达显著降低，Bcl-2蛋白表达显著升高（P<0.05）。见表2、图2。

表2 miR-543过表达对LPS诱导的气道上皮细胞损伤的影响（±s，n=9）Tab.2 Effect of miR-543 overexpression on LPS-induced airway epithelial cell damage（±s，n=9）

表2 miR-543过表达对LPS诱导的气道上皮细胞损伤的影响（±s，n=9）Tab.2 Effect of miR-543 overexpression on LPS-induced airway epithelial cell damage（±s，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P<0.05；compared with LPS+miR-NC group，2）P<0.05.

Groups Con LPS LPS+miR-NC LPS+miR-543 F P miR-543 1.00±0.05 0.53±0.051）0.51±0.04 0.86±0.072）185.843<0.01 IL-6/（ng·ml-1）56.32±5.88 136.25±11.251）139.58±10.52 69.33±6.252）221.135<0.01 IL-1β/（ng·ml-1）21.58±2.34 58.23±5.221）61.39±6.14 36.22±3.272）157.934<0.01 TNF-α/（ng·ml-1）95.36±9.28 183.62±13.471）188.25±14.62 125.32±10.272）126.265<0.01 Apoptosis rate/%6.32±0.63 27.14±2.771）29.82±2.84 11.36±1.172）275.604<0.01 Bcl-2 protein 0.69±0.06 0.27±0.031）0.25±0.03 0.58±0.052）223.101<0.01 Bax protein 0.32±0.03 0.76±0.071）0.78±0.08 0.40±0.042）149.130<0.01

图2 miR-543过表达对LPS诱导的气道上皮细胞凋亡的影响Fig.2 Effect of miR-543 overexpression on LPS-induced apoptosis of airway epithelial cells

2.3 miR-543靶向调控HDAC3的表达TargetScan在线分析显示，miR-543与HDAC3的3'UTR之间存在互补结合位点，见图3。miR-543 mimics与WTHDAC3共转染组BEAS-2B细胞荧光素酶活性较miR-NC和WT-HDAC3共转染组显著降低（P<0.05）；而miR-543 mimics与WT-HDAC3共转染组BEAS-2B细胞荧光素酶活性与miR-NC和WT-HDAC3共转染组比较差异无统计学意义，见表3。miR-543组BEAS-2B细胞HDAC3蛋白表达较miR-NC组显著降低；anti-miR-543组BEAS-2B细胞HDAC3蛋白表达较miR-NC组显著升高（P<0.05），见图4、表4。

表4 miR-543调控HDAC3蛋白的表达（±s，n=9）Tab.4 miR-543 regulates expression of HDAC3 protein（±s，n=9）

表4 miR-543调控HDAC3蛋白的表达（±s，n=9）Tab.4 miR-543 regulates expression of HDAC3 protein（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05；compared with antimiR-NC group，2）P<0.05.

Groups miR-NC miR-543 anti-miR-NC anti-miR-543 F P 0.43±0.04 0.21±0.021）0.40±0.03 0.86±0.072）347.846<0.01 HDAC3

图4 HDAC3蛋白表达Fig.4 HDAC3 protein expression

表3 双荧光素酶报告实验（±s，n=9）Tab.3 Dual luciferase report experiment（±s，n=9）

表3 双荧光素酶报告实验（±s，n=9）Tab.3 Dual luciferase report experiment（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05.

Groups miR-NC miR-543 t P WT-HDAC3 0.99±0.07 0.36±0.041）23.443<0.01 MUT-HDAC3 1.00±0.06 0.98±0.06 0.707 0.490

图3 HDAC3的3'UTR中含有与miR-543互补的核苷酸序列Fig.3 3'UTR of HDAC3 contains a nucleotide sequence complementary to miR-543

2.4 干扰HDAC3表达对LPS诱导的气道上皮细胞损伤的影响与Con组比较，LPS组BEAS-2B细胞HDAC3和Bax蛋白表达、凋亡率显著升高，Bcl-2蛋白表达显著降低，培养液上清中IL-6、IL-1β、TNF-α表达显著升高；与LPS+si-NC组比较，LPS+si-HDAC3组BEAS-2B细胞HDAC3和Bax蛋白表达、凋亡率显著降低，Bcl-2蛋白表达显著升高，培养液上清中IL-6、IL-1β、TNF-α表达显著降低（P<0.05）。见图5、表5。

表5 干扰HDAC3表达对LPS诱导的气道上皮细胞损伤的影响（±s，n=9）Tab.5 Effects of interfering with HDAC3 expression on LPS-induced airway epithelial cell damage（±s，n=9）

表5 干扰HDAC3表达对LPS诱导的气道上皮细胞损伤的影响（±s，n=9）Tab.5 Effects of interfering with HDAC3 expression on LPS-induced airway epithelial cell damage（±s，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P<0.05；compared with LPS+si-NC group，2）P<0.05.

Groups Con LPS LPS+si-NC LPS+si-HDAC3 F P HDAC3 protein 0.37±0.04 0.81±0.071）0.82±0.08 0.48±0.042）130.924<0.01 IL-6/（ng·ml-1）51.78±5.22 138.62±12.361）142.96±13.25 78.55±7.862）175.011<0.01 IL-1β/（ng·ml-1）22.65±2.27 63.59±6.281）64.87±6.33 40.57±4.852）135.931<0.01 TNF-α/（ng·ml-1）91.23±9.36 186.32±14.571）191.36±15.32 141.52±13.572）108.997<0.01 Apoptosis rate/%7.21±0.72 26.58±2.631）28.47±2.88 14.63±1.422）206.270<0.01 Bcl-2 protein 0.67±0.06 0.26±0.031）0.25±0.03 0.51±0.052）189.987<0.01 Bax protein 0.31±0.03 0.77±0.071）0.79±0.08 0.44±0.042）150.152<0.01

图5 干扰HDAC3表达对LPS诱导的气道上皮细胞凋亡的影响Fig.5 Effect of interfering with HDAC3 expression on LPS-induced apoptosis of airway epithelial cells

2.5 HDAC3过表达逆转了miR-543过表达对LPS诱导的气道上皮细胞损伤的作用与LPS+miR-NC组 比 较，LPS+miR-543组BEAS-2B细 胞HDAC3和Bax蛋白表达、凋亡率显著降低，Bcl-2蛋白表达显著升高，培养液上清中IL-6、IL-1β、TNF-α显著降低；与LPS+miR-543+pcDNA组比较，LPS+miR-543+pcDNA-HDAC3组BEAS-2B细胞HDAC3和Bax蛋白表达、凋亡率显著升高，Bcl-2蛋白表达显著降低，培养液上清中IL-6、IL-1β、TNF-α显著升高（P<0.05）。见表6、图6。

表6 HDAC3过表达逆转了miR-543过表达对LPS诱导的气道上皮细胞损伤的作用（±s，n=9）Tab.6 HDAC3 overexpression reverses effect of miR-543 overexpression on LPS-induced airway epithelial cell damage（±s，n=9）

表6 HDAC3过表达逆转了miR-543过表达对LPS诱导的气道上皮细胞损伤的作用（±s，n=9）Tab.6 HDAC3 overexpression reverses effect of miR-543 overexpression on LPS-induced airway epithelial cell damage（±s，n=9）

Note：Compared with LPS+miR-NC group，1）P<0.05；compared with LPS+miR-543+pcDNA group，2）P<0.05.

Groups LPS+miR-NC LPS+miR-543 LPS+miR-543+pcDNA LPS+miR-543+pcDNA-HDAC3 F P HDAC3 protein 0.83±0.07 0.42±0.041）0.40±0.03 0.72±0.072）136.073<0.01 IL-6/（ng·ml-1）141.36±13.25 68.23±6.821）66.98±6.63 120.54±12.012）123.726<0.01 IL-1β/（ng·ml-1）62.58±6.28 38.22±3.811）35.49±3.55 50.43±5.012）60.704<0.01 TNF-α/（ng·ml-1）189.25±13.54 117.36±11.471）115.93±12.53 168.37±13.422）75.158<0.01 Apoptosis rate/%27.22±2.73 12.24±1.251）11.73±1.18 21.58±2.162）135.471<0.01 Bcl-2 protein 0.24±0.03 0.57±0.051）0.59±0.06 0.36±0.032）130.329<0.01 Bax protein 0.76±0.07 0.39±0.041）0.37±0.03 0.65±0.062）122.045<0.01

3 讨论

微小RNA（microRNAs，miRNA）是由18~25个核苷酸组成的单链非编码RNA，其通过在转录后水平调控基因表达在包括哮喘在内的多种肺部疾病中发挥作用［6］。研究显示，哮喘患者中miR-192-5p表达下调，上调miR-192-5p可抑制Ⅰ型胶原蛋白沉积，减轻哮喘患者的气道重塑和气道平滑肌细胞自噬［7］。miR-20b可能通过调控血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达对哮喘小鼠气道炎症产生抑制作用［8］。上调miR-20a-5p通过调控信号转导和转录激活子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）表达可降低细胞的生存能力，促进TGF-β1引发的细胞凋亡，是哮喘治疗的潜在靶点［9］。LPS是一种内毒素，可诱导免疫细胞、非免疫细胞的炎症反应，诱导气道上皮细胞损伤［10-12］。本研究发现，LPS诱导后BEAS-2B细胞凋亡率、凋亡促进蛋白Bax表达、炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α分泌显著升高，miR-543表达降低，提示miR-543可能参与气道上皮细胞损伤。进一步功能获得实验验证miR-543功能发现，恢复miR-543表达可降低LPS诱导下炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α分泌水平，降低Bax蛋白表达，升高Bcl-2蛋白，抑制LPS诱导的BEAS-2B细胞凋亡。提示过表达miR-543可减轻LPS诱导的气道上皮细胞凋亡和炎症损伤。

HDAC3是HDAC家族成员之一，研究显示HDAC可能通过影响丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）、核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）通路，控制炎症细胞因子水平，最终引起哮喘小鼠气道炎症细胞浸润，增加气道炎症反应，使用HDAC抑制剂可缓解哮喘小鼠气道炎症、气道重塑和气道高反应［13-14］。然而，有研究指出，哮喘患者、香烟烟雾刺激的致敏大鼠气道HDAC2活性降低，与疾病的严重程度呈正相关［15-16］。本研究发现LPS诱导后BEAS-2B细胞中HDAC3表达显著升高，进一步功能缺失实验探索HDAC3功能作用发现，干扰HDAC3表达可降低LPS诱导下炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α分泌水平，降低Bax蛋白表达，升高Bcl-2蛋白，抑制LPS诱导的BEAS-2B细胞凋亡，与过表达miR-543作用相一致。同时，本研究发现HDAC3是miR-543的 下 游 靶 基 因，且miR-543对HDAC3具有负调控作用。过表达HDAC3能够逆转miR-543过表达对LPS诱导的气道上皮细胞凋亡和炎症损伤的影响。提示miR-543对LPS诱导的气道上皮细胞损伤的保护作用与调控HDAC3表达有关。

综上所述，miR-543通过靶向下调HDAC3可抑制LPS诱导的气道上皮细胞的凋亡和炎症损伤。因此，miR-543有望成为支气管哮喘防治的有效靶点。