罗哌卡因抑制M1型巨噬细胞极化缓解大鼠脑缺血再灌注损伤引起的免疫紊乱和组织氧化应激损伤①

肖旭 李光才 国小青 况小军

（贵州航天医院麻醉科，遵义 563000）

中风是中枢神经系统疾病最严重的原因之一，缺血性中风占中风的大多数，并伴随高病死率、致残率和复发率［1］。恢复脑血流量对于缺血性中风后的恢复至关重要。然而恢复血流会导致一系列病理生理级联反应，从而可能进一步损伤大脑，这一过程称为缺血再灌注损伤［2］。脑缺血再灌注损伤还与严重的残疾相关，加重了个人、家庭和社会的医疗保健负担［3］。迄今为止，还没有发现理想的脑缺血再灌注损伤治疗药物。因此，寻找有效的脑缺血再灌注损伤的防治药物是中风研究的紧迫问题。

相关研究表明，适宜的麻醉方式有助于降低患者氧化应激程度，减少细胞因子水平变化，改善脑组织缺血的再灌注损伤，从而促进患者恢复［4］。罗哌卡因（ropivacaine，ROP）是一种单一对映结构体长效酰胺类局麻药，通过抑制神经细胞钠离子通道，阻断神经的兴奋与传导［5］。ROP毒性较低，具有较高的安全性。目前尚无关于ROP对脑缺血再灌注损伤具体作用机制的研究报道。本文旨在探究ROP对大鼠脑缺血再灌注损伤引起的免疫紊乱和组织氧化应激损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物60只雄性SD级大鼠购自成都达硕实验动物有限公司，8周龄，体质量（185±10）g，许可证号：SCXK（川）2015-030。自然光照，常规饲养7 d。

1.1.2 试验药物与主要试剂罗哌卡因（S68348）购自上海源叶生物科技有限公司，化学式：C17H26N2O，分子量：274.4，纯度≥98%；苏木素-伊红染液（D006-1-1）、总超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（A001-3-2）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH）测定试剂盒（A005-1-2）、丙二醛（MDA）测定试剂盒（A003-1-2）均购自南京建成生物工程研究所；IL-6 ELISA测试盒（JK-a-0023）、IL-10 ELISA试剂盒（JK-a-5026）购自上海晶抗生物工程有限公司；Anti Arginase-1（ab60176）、iNOS（ab15323）、Caspase-3（ab13847）、cleaved Caspase-3（ab2302）、Bax（ab53154）、Bcl-2（ab196495）、c-Myc（ab39688）、β-actin（ab8227）购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立及分组按随机数字表法将大鼠分为5组：Control组、模型组（CI/R）、CI/R+ROP 0.5 mg/kg组、CI/R+ROP 1 mg/kg组 和CI/R+ROP 2 mg/kg组。CI/R+ROP 0.5 mg/kg组、CI/R+ROP 1 mg/kg组和CI/R+ROP 2 mg/kg组分别灌胃给予罗哌卡因0.5、1、2 mg/kg［6］，Control组和CI/R组灌胃给予等量生理盐水，连续灌胃7 d，于第7天灌胃1 h后参照LONGA等［7］方法建立脑缺血再灌注大鼠模型：将所有大鼠用10%水合氯醛麻醉，仰卧固定至操作台，大鼠颈部正中切口，分离左侧股静脉、左右两侧颈总动脉、椎动脉和右侧颈外动脉，除Control组外其余各组结扎并于颈总动脉分叉处开小口，将尼龙线沿颈总动脉插入颈内动脉直至有轻微阻力为止，缺血2 h后缝合切口。

1.2.2 HE染色取各组大鼠脑组织，先用10%甲醛固定48 h，然后石蜡包埋制作切片，厚切片5 µm后，苏木精、伊红染色。在400倍显微镜下观察脑组织损伤情况。

1.2.3 跳台实验将各组大鼠于实验前1 d置于反应箱中适应3 min，实验时将大鼠放在平台上并接通铜栅电源，记录各组大鼠3 min内错误次数（遭电击次数）；第2天直接将大鼠置于接通铜栅电源的平台上，记录3 min内错误次数。

1.2.4 Y迷宫实验Y迷宫具有3个臂，分为起始臂、新异臂和其他臂，将新异臂用隔板挡住，大鼠由起始臂放入，在起始臂和其他臂中自由活动10 min，训练结束后，大鼠被放回饲养笼。训练结束后4 h抽开新异臂隔板，大鼠由起始臂放入，在3个臂中自由活动5 min。录像记录5 min内每只大鼠在各个臂停留的时间和穿梭次数。统计并分析大鼠新异臂进入次数。

1.2.5 流式细胞术检测外周血清中巨噬细胞M1/M2极化取各组大鼠外周血0.5 ml于流式上样管，按抗体说明书和抗体组合方案，每管分别加5µl抗体，避光孵育20 min；400 g离心5 min，弃上清PBS清洗1次，54.8 g离心5 min，收集沉淀加500µl PBS重悬，300目筛过滤，30 min内上机检测，Cell Quest软件进行细胞分类分析。

1.2.6 ELISA在4℃下用50 mmol/L的碳酸盐包被缓冲液溶解抗原，100 µl/孔添加至96孔酶标板，将抗原包被过夜，弃去包被液，PBST洗涤3次，每次5 min，每孔加150 µl 1%BSA封闭1 h，PBST洗涤3次，加入100µl不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37℃孵育2 h，PBST洗涤5次，加入100 µl稀释后的HRP标记的二抗，37℃孵育1 h，PBST洗涤5次后显色剂显色20 min，用酶标仪测定。

1.2.7 氧化应激按照试剂盒说明书，采用酶标仪测定总SOD含量，采用可见分光光度计测定MDA、GSH含量。SOD在450 nm处测OD值，MDA在532 nm处测OD值，GSH在412 nm处测OD值。

1.2.8 Western blot将各组大鼠脑组织于冰上或4℃解冻，再加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行总蛋白提取，BCA试剂盒测定蛋白质含量；提取等量的蛋白质样品（20 mg），100℃变性5 min，然后进行SDS-PAGE凝胶电泳分离并转移至PVDF膜，5%BSA室温封闭1~2 h后加入相应一抗，4℃孵育过夜，次日清洗后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，清洗。最后加入发光液后，于凝胶成像仪进行曝光拍照，并用Image J软件统计灰度值计算相对表达量。β-actin作为上样量参照，至少重复3个独立的实验。

1.3 统计学分析所有实验数据均用SPSS19.0软件进行统计分析，实验结果以±s表示，两两比较用独立的t检验，组间差异采用单因素方差分析检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ROP改善脑缺血再灌注损伤大鼠病理损伤和学习能力HE染色检测各组大鼠脑组织病理损伤结果如图1A所示，Control组皮层神经元形态结构完整，排列规整，细胞核圆。CI/R组神经元细胞排列紊乱、细胞变形、细胞质体积小，细胞核深染，表现为明显脑缺血再灌注病理损伤。CI/R+ROP 1、2 mg/kg组病理损伤程度较CI/R组明显改善，神经元排列较整齐，细胞核固缩深染。跳台实验检测各组大鼠犯错次数结果如图1B，与Control组相比，CI/R组大鼠跳台实验中犯错次数增加（P<0.05）。与CI/R组相比，CI/R+ROP 1、2 mg/kg组大鼠跳台实验中犯错次数减少（P<0.05）；通过Y迷宫实验检测各组大鼠新异臂进入次数结果如图1C，与Control组相比，CI/R组大鼠新异臂进入次数减少（P<0.05）。与CI/R组相比，CI/R+ROP 1、2 mg/kg组大鼠新异臂进入次数增加（P<0.05）。

图1 ROP对脑缺血再灌注损伤大鼠病理损伤程度和学习能力的影响（×200）Fig.1 Effects of ROP on degree of pathological injury and learning ability of rats with cerebral ischemiareperfusion injury（×200）

2.2 ROP降低脑缺血再灌注损伤大鼠外周血中M1含量，升高M2含量通过流式分选检测各组大鼠外周 血 中 巨 噬细胞M1（F4/80+iNOS+）、M2（F4/80+Arg-1+）含量结果如图2所示，与Control组相比，CI/R组M1含量升高，M2含量降低（P<0.05）。与CI/R组相比，CI/R+ROP 1、2 mg/kg组M1含量降低，M2含量升高（P<0.05）。

图2 ROP对脑缺血再灌注损伤大鼠外周血中M1、M2含量的影响Fig.2 Effect of ROP on contents of M1 and M2 in peripheral blood of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury

2.3 ROP降低脑缺血再灌注损伤大鼠IL-6含量，升高IL-10含量ELISA检测各组大鼠IL-6、IL-10含量结果如图3所示，与Control组相比，CI/R组IL-6含量升高，IL-10含量降低（P<0.05）。与CI/R组相比，CI/R+ROP 1、2 mg/kg组IL-6含量降低，IL-10含量升高（P<0.05）。

图3 ROP对脑缺血再灌注损伤大鼠IL-6、IL-10含量的影响Fig.3 Effect of ROP on IL-6 and IL-10 levels in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury

2.4 ROP上调脑缺血再灌注损伤大鼠Arg-1蛋白表达水平，下调iNOS蛋白表达水平Western blot检测各组大鼠脑组织中Arg-1、iNOS蛋白表达水平结果如图4所示，与Control组相比，CI/R组Arg-1蛋白水平降低，iNOS蛋白水平升高（P<0.05）。与CI/R组相比，CI/R+ROP 1、2 mg/kg组Arg-1蛋白水平升高，iNOS蛋白水平降低（P<0.05）。

图4 ROP对脑缺血再灌注损伤大鼠Arg-1、iNOS蛋白表达水平的影响Fig.4 Effects of ROP on expression levels of Arg-1 and iNOS in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury

2.5 ROP升高脑缺血再灌注损伤大鼠SOD、GSH含量，降低MDA含量试剂盒检测各组大鼠SOD、GSH、MDA含量结果如图5所示，与Control组相比，CI/R组SOD、GSH含量降低，MDA含量升高（P<0.05）。与CI/R组 相 比，CI/R+ROP 1、2 mg/kg组SOD、GSH含量升高，MDA含量降低（P<0.05）。

图5 ROP对脑缺血再灌注损伤大鼠SOD、GSH、MDA含量的影响Fig.5 Effects of ROP on SOD，GSH and MDA contents in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury

2.6 ROP降低脑缺血再灌注损伤大鼠Bax/Bcl-2、cleaved Caspase-3/Caspase-3，上调c-Myc蛋白表达水 平Western blot检 测 各 组 大 鼠Bax、Bcl-2、Caspase-3、c-Myc蛋白表达水平结果如图6所示，与Control组相比，CI/R组Bax/Bcl-2、cleaved Caspase-3/Caspase-3升高，c-Myc蛋白水平降低（P<0.05）。与CI/R组 相 比，CI/R+ROP 1、2 mg/kg组Bax/Bcl-2、cleaved Caspase-3/Caspase-3降低，c-Myc蛋白水平升高（P<0.05）。

图6 ROP对脑缺血再灌注损伤大鼠Bax、Bcl-2、Caspase-3、c-Myc蛋白表达水平的影响Fig.6 Effect of ROP on expression levels of Bax，Bcl-2，Caspase-3 and c-Myc in rats with cerebral ischemiareperfusion injury

3 讨论

本实验通过构建脑缺血再灌注大鼠模型，观察ROP对脑缺血再灌注损伤的影响。跳台实验考察动物的被动记忆能力，Y迷宫实验则研究啮齿类动物的空间识别记忆能力，该迷宫利用啮齿类动物对新异环境天然探究的自然习性，不需要动物学习任何规则趋利避害，能有效反映动物对新异环境的识别记忆能力［8］。本研究发现，CI/R组大鼠对新环境的识别能力降低，且犯错次数增多，而ROP可增加大鼠对新环境的探索和记忆能力，并减少跳台实验犯错次数。说明ROP可改善脑缺血再灌注大鼠学习记忆功能障碍。

脑缺血再灌注损伤的炎症反应是由小胶质细胞、星形胶质细胞及巨噬细胞激活释放细胞因子和趋化因子介导外周炎症细胞的浸润形成的炎症微环境［9］。小胶质细胞/巨噬细胞在中枢神经系统中可激活极化为M1、M2型小胶质细胞［10］。调控小胶质细胞/巨噬细胞向M1型极化可加重脑损伤，向M2型极化可发挥脑保护作用［11］。诱导型一氧化氮合酶（iNOS）是M1型标志物，精氨酸酶1（Arg-1）是M2型标志物。本文研究发现，ROP具有降低脑缺血再灌注损伤大鼠外周血中M1含量及iNOS蛋白水平，升高M2含量及Arg-1蛋白表达水平的作用。提示ROP调控小胶质细胞向M2型极化，对脑缺血再灌注损伤大鼠具有保护作用。

炎症反应在脑缺血再灌注损伤过程中发挥非常重要的作用，是造成脑组织再灌注损伤的主要因素，缺血脑组织中促炎细胞因子的大量表达促进炎症反应进程，加重脑组织的缺血再灌注损伤［12］。IL-6是白细胞介素家族中多功能的细胞因子，可通过减少炎症因子的分泌或加强抗炎分子的表达，在脑缺血后，IL-6的表达活性增加，在脑缺血再灌注进展过程中起促进作用［13］。IL-10可上调炎症因子拮抗剂的表达、抑制NF-κB活性，通过不同途径抑制TNF-α和IL-1β活性，减少NO的合成和分泌，发挥抗炎效应［14］。本研究发现，ROP具有降低脑缺血再灌注损伤大鼠IL-6含量，升高IL-10含量的作用。提示ROP抑制炎症因子的释放改善脑缺血再灌注大鼠脑组织损伤。

由于脑组织中含有大量的不饱和脂肪酸和高浓度的脂质，抗氧化能力较弱，致使大脑容易受到氧自由基的损伤。机体氧化和抗氧化系统之间的稳态被破坏而形成的氧化应激状态是脑缺血再灌注损伤的关键机制［15］。SOD、GSH属于内源性抗氧化酶，通过维持组织低浓度氧化剂和氧化还原平衡状态发挥抗氧化应激作用，MDA可反映脂质过氧化程度与细胞损伤程度。陈人豪等［16］研究发现刺五加提取物通过升高SOD、GSH活性，降低MDA含量提高脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织的抗氧化能力。本文研究发现，ROP具有升高脑缺血再灌注损伤大鼠SOD、GSH含量，降低MDA含量的作用。提示ROP通过抗氧化应激对脑缺血再灌注损伤大鼠具有保护作用。

凋亡是脑缺血再灌注损伤过程中的重要机制，抑制神经元细胞凋亡可减轻脑缺血再灌注损伤［17］。促凋亡蛋白Bax为小分子细胞色素C提供通道，由线粒体进入胞质而促进细胞凋亡，而Bcl-2蛋白能与Bax蛋白形成同源二聚体抑制Bax活性，关闭Bax通道而阻止小分子通过拮抗Bax促凋亡作用。Bcl-2/Bax可反映细胞凋亡情况［18］。Caspase家族是细胞凋亡的介导者及执行者，Caspase-3处于凋亡有序级联反应的下游，是家族中的最重要的凋亡执行者之一，是多种凋亡刺激信号传递的汇聚点［19］。c-Myc是一种细胞原癌基因，通过调控细胞周期可诱导细胞增生，也可介导细胞凋亡［20］。高亮等［21］研究发现，c-Myc在局灶性脑缺血再灌注大鼠模型中表达增加，参与脑缺血再灌注损伤的发病机制，引发神经细胞凋亡。本研究发现，ROP具有降低脑缺血再灌注损伤大鼠Bax/Bcl-2、cleaved Caspase-3/Caspase-3，上调c-Myc蛋白表达水平的作用。提示ROP可抑制脑缺血再灌注大鼠神经元细胞凋亡。

综上所述，ROP改善脑缺血再灌注大鼠病理损伤程度和学习记忆功能，其可能是通过抑制M1细胞极化改善免疫紊乱、抑制炎症因子释放抗氧化应激和下调凋亡蛋白表达等实现的，且具有剂量依赖性。