生青味缺陷型酱香白酒风味特征分析

孙优兰，黄永光*，胡 峰，程平言，尤小龙，陆伦维

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州茅台酒厂（集团）习酒有限责任公司，贵州 遵义 564622）

酱香型白酒是我国三大传统香型白酒中风味极其复杂而独特的酒种，其生产过程中的原酒或基酒常伴有缺陷特征，使酒体香气和口感平衡失调，其中生青味则是酒体中常见的一种异嗅味，且还伴有口感微涩等特征[1]。对黄酒异嗅味的研究结果表明[2]，导致该特征缺陷酒体的主要原因是酿酒原料中蛋白质水解产生的氨基酸态氮含量过高，从而导致大量的高级醇（杂醇）、醛、酮等物质生成，进而形成“生青味”缺陷特征，但并未具体说明是哪些物质，同时，在白酒研究领域也鲜见该缺陷特征的相关研究及其报道。生产实践表明生青味的出现不仅严重影响产品质量，给企业造成经济损失，甚至还一定程度上制约了白酒产业的发展。

感官风味是评价白酒品质的重要指标，且通过结合仪器分析对酱香型白酒中异嗅味化合物的研究是认识酒体缺陷和提升质量的重要前提和途径。近年来，乔敏莎[3]采用感官品评结合顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）确定了酱香型白酒中的臭味物质；王尹叶等[4]采用感官导向结合GC-MS分析方法成功建立了一种白酒中挥发性苦味和涩味化合物的提取、分离和鉴定方法；赵腾飞等[5-7]采用味觉稀释分析感官强度为导向结合仪器分析分离鉴定了酱香型白酒中的后鼻嗅糊味化合物和苦味化合物。可见，随着科技发展和行业研究人员的努力，在酱香型白酒异嗅味化合物研究方面取得较多研究成果，但就目前的研究进展而言，存在研究手段较为单一，且目前研究仅涉及盐菜味、泥臭味、糊味酒体，生青味、馊味、油味等酒体的异嗅味鲜见相关报道，同时对于异嗅味缺陷酒，可能存在多种呈异嗅味的成分，并且由多种风味化合物互作导致，一定程度上使科研工作者在克服仪器设备、技术方法等困难的同时对酱香型白酒异嗅味化合物的研究仍然停留在客观层面，给异嗅味物质的形成机制认识及其相关研究带来较大困难。

代谢组学在医学[8]、营养科学[9]、毒理学[10]等方面广泛应用。该方法首先利用高通量、高灵敏度、高分辨率的实验仪器定性定量分析样品中所有的小分子物质，结合多元统计分析方法，从海量数据中比较分析出有意义的标记物，最后再对该标记物进行验证、解释和分析[11]。目前，广泛应用于代谢组学数据采集的技术平台有GC-MS[12]、液相色谱-质谱[13]、核磁共振[14]技术等，其中GC-MS和液相色谱-质谱具有灵敏度高、选择性好、通量高等优势[15]。截至2013年，“酒代谢组学”[16]的出现说明代谢组学已经成功应用于酒类研究领域，且基于非靶向和靶向代谢组学的研究思路和技术正在为酒类风味物质的新发现提供一条快捷便利的通道[17]。

基于此，本研究拟对酱香型白酒中的生青味缺陷酒展开研究，以非靶向代谢组学和感官风味为导向的研究策略为指导，借助仪器分析和化学计量学工具为辅助，全面解析酱香生青缺陷酒样中的特征风味化合物结构，以正常风味酒样为对照，对生青缺陷酒体特征风味化合物进行差异统计及正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA），以期找出目标差异特征化合物，为酱香型白酒品质提升提供科学依据。同时基于该研究方法的建立，为酱香型白酒中异嗅味的研究提供了重要思路，还对明晰酱香型白酒的特征风味，以及食品体系中符合复合型特征风味的解析提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酒样：生青味基酒（SQ）、正常味基酒（ZC）样品均采自XJ公司，在感官初筛的基础上挑选出3个生青味酒样和3个正常味酒样（乙醇体积分数53%，500 mL/个）。所采集酒样均统一置于10 ℃以下干燥贮存，待测。

正构烷烃混合标准品（C7～C40）、2-辛醇、乙醇、2-乙基丁酸、乙酸正戊酯、乙酸乙酯、丙酸乙酯、正丙醇、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、辛酸乙酯、糠醛、2-乙酰基呋喃、苯甲醛、5-甲基-2-乙酰基呋喃、癸酸乙酯、3-甲基丁酸、苯甲酸乙酯、3-甲硫基-1-丙醇、2-苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯甲醇、苯乙醇、苯酚、苯乙醛、2,3-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-庚醇、乳酸乙酯、正庚醇、丁二酸二乙酯、正丁醇、2-丁醇、正戊醇、2-戊醇、丙醇、棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯（分析级标准品，纯度均大于98%） 上海国药集团化学试剂有限公司；超纯水由实验室制备。

1.2 仪器与设备

GC 7890-5975 MSD GC-MS联用仪 美国安捷伦公司；MPS2型多功能自动进样系统 德国Gerstel公司；50/30 μm二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷萃取头 美国Supelco公司；SB25-12DT超声波清洗器宁波新芝生物科技股份有限公司；Aquaplore3S超纯水系统 美国艾科浦公司；AR2130/C电子天平 奥豪斯仪器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 感官品评小组的建立

根据文献[18]方法，建立酱香酒体感官品评小组，各成员均具有2 a以上的品评训练经验，且均通过基本味觉测试和嗅味标度测试、差别检验及嗅味描述检验，最终选择敏感度和识别能力较强的品评员构成最终的品评小组。小组成员共18 人，年龄在20～45 岁之间，其中3 名具有10 a以上白酒品评经验的教师（国家评委、省级评委、国家一级品酒师），研究生7 人，另外8 人为XJ公司尝评工作室人员，均具有国家一级品酒师以上资质。0～5 分制，0 分代表无明显感官强度，5 分代表强烈感知。

1.3.2 真空旋转蒸发

取200 mL缺陷酒样置于1 000 mL旋转蒸发瓶中进行真空旋转蒸馏，设置水浴加热温度45 ℃，真空度0.085～0.095 MPa，蒸馏至5 min内没有液体滴出记为蒸馏结束，收集得到挥发性组分与难挥发性组分，并将收集组分复溶至原始乙醇体积分数，用于感官品评。

1.3.3 基于感官导向的异嗅味组分分离提取方法

参考Wang Li等[19]的方法，并适当调整。50 mL挥发性组分用去离子水稀释至乙醇体积分数为10%，加入3 g NaCl至饱和。60 mL乙醚萃取3 次，静置分层后取上层萃取液，合并3 次萃取液并记为萃取相I。萃取相I将进一步分离成酸性、中碱性、水溶性3个组分。

50 mL饱和去离子水加入到萃取相I中，以25% NaOH溶液调节pH值至10，待静置分层，然后分离保存。其中，上层组分记为萃取相II，下层组分记为水相I。以25% NaOH溶液调节水相I pH值至2，并加入3 g NaCl饱和，然后用40 mL乙醚萃取3 次，静置分层后取上层有机相保存并记为萃取相III，将萃取相III用适量无水Na2SO4进行干燥过夜，得到酸性组分。20 mL饱和去离子水水洗萃取相II，静置分层后分离得到上层组分记为萃取相IV，下层组分记为水相II，将萃取相IV利用无水Na2SO4进行干燥过夜，得到中/碱性组分。水相II加入3 g NaCl进行饱和，然后用40 mL乙醚萃取3 次，分离得到上层组分记为萃取相V，然后无水Na2SO4进行干燥过夜，得到水溶性组分。

将收集得到的3种有机相组分分别平均分成2 份，一份氮吹浓缩至250 μL，保存于4 ℃冰箱中直至检测。另一份加入20 mL去离子水进行水洗，并使用真空旋蒸蒸发去除多余的有机溶剂，再加入10 mL 53%乙醇溶液，用于感官品评，最终选择异嗅味强度较大的亚组分进行GC-MS检测分析。以上感官评定均采用定量描述性分析方法进行六点刻度法（0～5 分）定量分析，通过3 次以上重复嗅闻打分，最终以评分均值为其结果。

1.3.4 检测条件

GC条件：DB-FFAP色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；GC检测器和进样口温度为250 ℃；不分流进样；氦气作为载气，流量2 mL/min；程序升温：色谱柱初温40 ℃维持2 min，以3 ℃/min升温到110 ℃，再以3.5 ℃/min升温至230 ℃，并保持该温度15 min。

MS条件：电子电离源；离子源温度230 ℃；电子能量70 eV；四极杆温度150 ℃；质量扫描范围m/z25～550。

1.3.5 定性分析

利用Agilent ChemStation将原始数据依次进行去除噪音、基线矫正和峰面积积分等步骤，并转换成统一识别格式（.csv），利用NIST 11a. L谱库检索、标准品比对，并结合保留指数（retention index，RI）进行挥发性化合物的定性。RI定性：根据改进的Kovats法[20]计算RI，C7～C40正构烷烃在与酒样相同的色谱条件下进样分析，通过保留时间计算未知化合物的RI，按式（1）计算：

式中：n和n+1分别为未知物流出前后正构烷烃碳原子数；tn和t（n+1）分别为相应正构烷烃的保留时间/min；ti为未知物的保留时间（tn＜ti＜t（n+1））。

1.3.6 定量分析

有标样的化合物用全定量，无标样的化合物采用内标法定量。

标准曲线定量：配制体积分数10%乙醇溶液，经NaCl饱和、稀盐酸调节pH值之后，作为标准曲线模型溶液，加入已知浓度待测物标准储备液，并进行梯度稀释，制成系列待检标准化合物溶液。加入同样品一致的混合内标溶液（2-辛醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸），进行GC-MS检测分析，检测条件与前述一致。采用选择特征离子法扫描进行测定。其中，酸类物质和醇类物质分别由2-乙基丁酸和2-辛醇计算得出定量结果，酯类及其他成分由乙酸正戊酯计算得出定量结果。最后，以待测物与相应内标物质的峰面积比为纵坐标，质量浓度比为横坐标，使用Agilent ChemStation建立内标曲线并计算每种化合物的质量浓度。同时以信噪比大于3时的质量浓度为检出限，信噪比大于10时的质量浓度为定量限。

内标法定量：通过计算内标物的峰面积和样品中各组分的峰面积比值，从而定量出各个风味成分的含量，每个组分测定3 次取平均值。

1.4 数据处理

数据相关分析及图像处理采用SPSS、R语言、SIMCA-P、Adobe AI软件。

2 结果与分析

2.1 生青味缺陷酒体的感官特征

采用真空旋转蒸发方法将200 mL样品进行预分离，得到挥发性组分和非挥发组分，同时进行感官品评，结果如表1所示。

表1 低温减压蒸馏分离组分感官品评Table 1 Sensory evaluation of fractions from gradient vacuum distillation

由表1可知，3个生青味缺陷型酒样品在挥发性组分中感官品评结果均大于3.6 分，可初步锁定导致该缺陷产生的特征风味化合物主要存在于挥发性组分中。进一步对预分离得到的挥发性组分采用乙醚溶剂萃取，分离得到酸性组分、中/碱性组分和水溶性组分，对其进行感官品评，结果如表2所示。

表2 乙醚溶剂萃取组分感官品评Table 2 Sensory evaluation of fractions from diethyl ether extraction

在预分离的基础上采用乙醚进行萃取，可进一步实现异嗅味化合物的分离。由表2可知，生青味主要存在于中/碱性亚组分中，而在酸性和水溶性组分中均没有感知到，说明溶剂萃取可以缩小异嗅味化合物的检测范围，同时进一步对中/碱性组分进行仪器分析，有助于解析生青味缺陷特征的化学组成。

2.2 生青味缺陷酒体风味化合物结构

GC-MS检测图谱经提取和匹配后，通过非靶向代谢组质谱数据库比对、标准品比对和RI鉴定，以及课题组前期研究工作的基础上，最后在生青味缺陷酒分离的中/碱性组分中共鉴定出94 种风味化合物，其中包括酯类37 种，醇类15 种，醛酮类5 种，呋喃类5 种，苯环类18 种，吡嗪类4 种，以及一些杂环类、烷烃类和其他类化合物10 种。对这些化合物进行种类及含量的比较统计分析，如图1所示。

图1 GC-MS定性定量生青味缺陷酒中的挥发性化合物Fig. 1 Volatile compounds in Baijiu with green off-flavor identified by GC-MS

酯类化合物是白酒中重要的一类骨架成分，该类化合物既能通过生物代谢途径产生（如梭菌、酿酒酵母等微生物的代谢），又能通过非生物途径产生（如酸和醇的酯化反应）[21-22]。根据统计，3个生青味缺陷酒（SQ1、SQ2和SQ3）中的酯类化合物种类分别为48、51 种和46 种，质量浓度分别为2 308.31、1 916.22 mg/L和2 136.87 mg/L，占风味化合物总含量的53.67%、40.03%和47.07%。进一步分析显示，3个样品中质量浓度均较高的酯类主要有乳酸乙酯（1 006.24～1 035.78 mg/L）、乙酸乙酯（580.47～1 070.26 mg/L）、2-糠酸乙酯（66.44～9.26 mg/L）和棕榈酸乙酯（43.42～43.79 mg/L）等。其中，棕榈酸乙酯是白酒中常见的三大高级脂肪酸乙酯之一，含量过高，则会引起白酒浑浊，过低的酒体余味不足，但该物质与酒体中其他风味成分的相互作用还有待进一步研究。本研究检出的2-糠酸乙酯在白酒中为首次检出，文献资料表明，该物质具有似青苹果、猕猴桃的香气，常于果酒中检出[23]，但其对白酒的风味品质影响还需进一步研究。此外，在本研究中首次检出的酯类还有DL-2-己酸乙酯（33.31～43.29 mg/L）和甲氧基乙酸-3-甲基丁酯（4.63～5.85 mg/L），该2 种化合物的风味贡献未知，本课题组正在开展相关研究。

醇类化合物是白酒中醇甜和助香的重要成分，主要通过酿酒酵母发酵代谢以及蛋白质分解产生[24]。统计发现3个生青缺陷酒中定量检出该类化合物种类分别为21、21 种和20 种，质量浓度分别为1 382.51、2 208.05 mg/L和1 779.19 mg/L，分别占风味化合物总含量的32.15%、46.13%和39.19%。3个样品中质量浓度均较高的醇类化合物主要包括异戊醇（728.02～1 128.87 mg/L）、正丙醇（373.87～543.93 mg/L）、异丁醇（194.61～328.74 mg/L）和正丁醇（36.95～108.21 mg/L）等，且上述这几种物质均以SQ2中质量浓度最高。

检出芳香族类化合物种类仅次于酯类化合物，3个生青缺陷酒中分别检出芳香族化合物23、23种和20 种。虽然该类化合物在白酒中含量较低，但它们香味突出，对白酒风格特征的形成具有重要贡献作用[25]。通过定量发现生青缺陷酒中检出芳香族类化合物质量浓度分别为104.75、132.33 mg/L和114.65 mg/L，相对含量占比分别仅为2.43%、2.76%和2.52%。其中，质量浓度均较高的主要有苯乙醇（347.88～349.00 mg/L）、苯乙酸乙酯（26.73～38.63 mg/L）以及苯甲醛（7.28～118.58 mg/L）等。

醛酮类化合物主要来源于脂肪氧化和氨基酸降解[26]。在生青缺陷酒中检出质量浓度主要分布于5.64～11.77 mg/L，占风味物质总含量的0.12%～0.25%。质量浓度较高的主要有环戊酮（2.09～3.44 mg/L）、苯基丙酮（0.83～1.23 mg/L）以及2-庚酮（0.68～1.34 mg/L）。吡嗪类化合物是酱香型白酒中种类和含量均较高的一类化合物[21]。在生青味缺陷酒中检出质量浓度主要在8.89～13.64 mg/L之间，占风味化合物总含量的0.19%～0.31%。其中，质量浓度较高的主要有2,6-二甲基吡嗪（2.48～2.84 mg/L）、2-乙基-6-甲基吡嗪（3.16～3.84 mg/L）、2,3,5-三甲基吡嗪（2.10～2.69 mg/L）；呋喃类化合物中以糠醛（451.58～464.56 mg/L）含量最高，其次为五甲基呋喃醛（9.92 mg/L左右）。

2.3 生青味缺陷酒体与正常味酒体之间的异同

为更深入解析酱香生青缺陷酒的风味结构特征，选取同一批次生产的3个相应正常酒样在相同条件下进行对比检测分析，其定性定量结果作为生青味缺陷酒的对照，采用Venn及聚类热图进行比较分析，如图2所示。

3个正常酒样中定性定量检出共有化合物90 种，与生青味缺陷酒对比发现（图2a），2 种类别样品之间检出风味成分共计126 种，其中共有风味成分58 种，质量浓度均较高的成分主要有乳酸乙酯、乙酸乙酯、异戊醇、正丙醇、异丁醇、正丁醇、糠醛等，同时发现生青味缺陷酒中异戊醇（928.44 mg/L）、异丁醇（261.67 mg/L）、糠醛（458.07 mg/L）、棕榈酸乙酯（43.60 mg/L）以及油酸乙酯（4.66 mg/L）等化合物含量远高于正常酒；生青味缺陷酒中检出特征性成分36 种，质量浓度较高的主要有2-糠酸乙酯、DL-2-己酸乙酯以及2-羟基-3-甲基丁酸乙酯等，但对这些物质的香味作用还需进一步研究。

图2 生青味缺陷酒与正常酒之间的统计分析Fig. 2 Statistical analysis of unique and shared flavor compounds between Baijiu with green off-flavor and normal Baijiu

在组学研究中，聚类热图通常作为对实验数据分布情况进行分析的直观可视化方法，可用于实验数据的质量控制和差异数据的具象化展示。基于此，采用无监督聚类热图统计比较分析生青味缺陷酒与正常酒中风味化合物之间的相似度和差异，如图2b所示。生青味缺陷酒与正常酒样被显著分成2 大类，表明生青味缺陷酒与正常酒样风味化合物含量间存在显著差异；且各样品的3个平行检测均分别聚类，说明本研究的实验条件以及仪器具有较好的稳定性。本研究结果可以说明酒体中风味化合物含量差异对于酒体风格、品质具有重要的影响，因此，也为后续的代谢组学分析提供了前提基础。

2.4 生青味缺陷酒体中的目标差异代谢化合物

作为组学分析思路的一种，OPLS-DA可以实现对2 组数据的全谱分析，以最大化地凸显模型内部不同组别之间的差异，同时还可以利用不同算法，对模型进行优化。因此，为进一步探讨生青味缺陷酒中的目标异嗅味化合物，本研究进一步对生青味缺陷酒与正常味酒的全面定量分析结果进行有监督的OPLS-DA，如图3所示。判别模型中R2和Q2分别表示在随机化Y变量模型下对数据的解释程度和对模型的预测能力，通过计算，本实验模型R2=0.862，Q2=0.99，说明该模型对酱香型白酒生青风味品质的拟合效果较好。

图3 生青味缺陷酒与正常酒的OPLS-DAFig. 3 OPLS-DA of differential flavor compounds between Baijiu with green off-flavor and normal Baijiu

由图3a可知，生青味缺陷酒样品位于X轴的左侧，正常酒样品位于X轴的右侧，2 种样品有明显分区，说明生青味缺陷酒与正常酒之间风味化合物具有明显差异，与聚类热图统计分析结果一致。两者之间的目标差异性成分通过变量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值及S-line图表现，当VIP值大于1认为是生青味缺陷酒的差异性化合物，而S-line图则可直观地表现差异化合物，如图3b所示，其中Y轴分为上下两部分，上部分表示为生青味缺陷酒中化合物含量相对于正常酒偏大，下部分则表示化合物含量相对于正常酒偏小，而峰的高低则与VIP值大小一致，峰越高，VIP值则越大。根据前述方法筛选得到的生青味缺陷酒差异化合物见表3，共得到15个目标差异成分，主要为醇类及酯类化合物。根据S-line图并结合表3可知，在生青味缺陷酒中含量偏大的化合物主要有乳酸乙酯（VIP=4.364 89）、异戊醇（VIP=3.630 36）、糠醛（VIP=3.364 37）、2-糠酸乙酯（VIP=2.467 92）、异丁醇（VIP=1.919 03）、DL-2-己酸乙酯（VIP=1.728 04）以及棕榈酸乙酯（VIP=1.384 72）。文献[27]表明，乳酸乙酯、异戊醇、异丁醇以及糠醛是酒体中苦味和涩味关键贡献化合物，含量越高，则酒体越加苦涩，因此，进一步可以说明这几种化合物可能是导致生青味酒体伴有苦涩特征的重要因素；根据对啤酒和葡萄酒中生青味的研究报道[2,28-32]，以异丁醇、异戊醇为代表的高级醇类和以乙醛为代表的醛类是构成酒体生青味缺陷特征的重要因素；同样，相关研究[31]也发现通过发酵控制醇类和酯类的含量可以明显改善酒体中的生青味缺陷。因此，在其他类型酒体的研究基础上，可助力推测本研究中上述酯类和醇类化合物可能是造成酱香型白酒中生青味缺陷特征产物的原因。同时，值得一提的是，2-糠酸乙酯和DL-2-己酸乙酯作为生青味缺陷酒中新检出的风味化合物，它们对生青味缺陷特征的影响还有待进一步验证。在生青味缺陷酒中含量偏小的化合物主要有1-乙氧基-2-丙醇（VIP=4.275 4）、乙酸乙酯（VIP=3.121 76）、正丙醇（VIP=3.040 43）、正丁醇（VIP=2.919 34）、戊酸乙酯（VIP=1.565 74）、丁酸乙酯（VIP=1.409 26）、苯乙醇（VIP=1.186 14）和糠醇（VIP=1.129 97），生青味缺陷酒和正常酒之间各差异化合物的含量呈现出不同程度的升高或降低趋势，基于2 种类别酒体特征性化合物的研究结果，本结果表明生青味缺陷酒的风味缺陷与其特征差异性化合物具有显著相关性，其具体的化合物及其呈风味机制本课题组正在进一步研究和验证。

表3 生青味缺陷酒与正常酒的差异性化合物Table 3 Differential components between Baijiu with green off-flavor and normal Baijiu

3 结 论

本研究以酱香型生青味缺陷酒为对象，首次将基于GC-MS的非靶向代谢组学和感官风味为导向的靶向研究策略应用于酱香型生青味缺陷酒体风味研究，并结合多种统计分析快速、全面表征酱香生青味缺陷酒样酒体中的特征风味化合物结构，实现了生青味目标代谢化合物的标记。通过检测分析，从生青味酒样中共检出94 种风味化合物，以酯类、醇类和芳香族类化合物为主；以正常风味酒样酒体为对照，应用Venn和热图统计发现生青味缺陷酒与正常酒样含量间存在显著差异，进一步开展组间风味化合物的OPLS-DA，共得到15个主要差异成分，主要为醇类及酯类化合物，包括1-乙氧基-2-丙醇、异戊醇、正丙醇、正丁醇、乳酸乙酯、2-糠酸乙酯、DL-2-己酸乙酯等。其中以乳酸乙酯、异戊醇、异丁醇以及糠醛为主的酯类及高级醇类化合物等可能是构成酱香白酒生青味缺陷特征的重要因子，也是导致生青味酒体伴有苦涩特征重要原因；同时，2-糠酸乙酯和DL-2-己酸乙酯作为生青味缺陷型酱香白酒中新检出的风味化合物，它们对生青味缺陷特征的影响还有待进一步验证。综上，本研究通过OPLS-DA确定酱香白酒生青味缺陷酒与正常酒中显著候选香气化合物，是识别导致感官差异的重要芳香化合物的基本策略，可用于评估生产中涉及的其他参数对酒精饮料质量和风味特征的影响。