奶牛乳房炎源大肠埃希氏菌的耐药性分析和毒力基因检测

刘肖利，刘璐瑶，李镔罡，李 斌，裴文刚，程 彪，苏战强*,李勤凡

(1.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2. 西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)属于环境性致病菌，是引起奶牛乳房炎、子宫内膜炎、腹泻病和败血症等疾病的主要病原菌[1]。近几年，由大肠埃希氏菌引起的乳房炎发病率已增至28.39%[2]，其中环境污染是该病感染的主要来源，一般治愈率相对较低，给动物乳腺组织造成永久性的损伤[3]，导致产奶量和乳制品质量明显降低，给奶产业造成了巨大的经济损失，严重威胁着人类的健康[4]。目前在治疗大肠埃希氏菌性乳房炎时主要以抗生素为主，但随着临床治疗过程中抗菌药物的不合理使用，导致大肠埃希氏菌的耐药性逐渐增强，其多重耐药现象也呈上升趋势[5]。大肠埃希氏菌的致病性与其携带的多种毒力基因有关[6-7]，主要包括黏附素基因、毒力岛基因、外膜蛋白基因等[8-9]。新疆地区是我国畜牧业大省，奶产业在新疆经济中占有重要的地位，但奶牛乳房炎的流行严重制约了奶产业的发展，为了解目前新疆部分地区大肠埃希氏菌性奶牛乳房炎的致病性与耐药性，从新疆乌鲁木齐、伊犁、昌吉地区的7个奶牛场采集乳房炎奶牛牛乳样本，分析新疆部分地区引起奶牛乳房炎的大肠埃希氏菌毒力基因携带及耐药情况，为牛场奶牛乳房炎的防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本采集及处理 2019年9月至2020年6月，在新疆乌鲁木齐、伊犁、昌吉地区7个奶牛场(奶牛场编号为A～G)采集142头乳房炎患病奶牛的乳汁样本，共142份。采样前先将患病奶牛的乳头清洗干净后，再用750 mL/L的酒精棉擦拭，使用消毒纸巾擦干后，将前3把乳汁弃去，采集第3把以后的乳汁置于50 mL无菌管中，做好标记后放入采样箱送实验室检测。

1.1.2 主要试剂 革兰氏染色液，珠海贝索生物技术有限公司产品；脑心浸出液肉汤(Brain Heart Infusion Broth BHI)、Mueller-Hinton琼脂(MH)、麦康凯琼脂(MacConkey Agar)、伊红美蓝琼脂(Eosin Methylene Blue Agar)，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司产品；2×TaqPCR Master Mix、ddH2O，生工生物工程(上海)股份有限公司产品；PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；11种肠杆菌科细菌生化鉴定管、13种药敏纸片：氧氟沙星、环丙沙星、链霉素、庆大霉素、头孢唑啉、头孢他啶、阿莫西林、氨苄西林、青霉素G、克林霉素、红霉素、复方新诺明、四环素，杭州滨和微生物试剂有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 普通光学显微镜，Nikon公司产品；SW-CJ-2FD型净化工作台，上海博讯实业有限公司医疗设备厂产品；DYY-7C型电泳仪，北京六一生物科技有限公司产品；PCR扩增仪，Eppendorf公司产品；DHP-9082B型恒温培养箱，上海恒科学仪器有限公司产品；TS-2102C型恒温振荡器，山海天呈实验仪器制造有限公司产品；HVE-50型高温高压灭菌锅，日本Hirayayama制造公司产品；凝胶成像分析系统,Transilluminator Jvlabo公司产品。

1.1.4 实验动物 健康昆明系小鼠，雌雄各半，体重20 g～25 g，共245只，购自新疆医科大学实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 大肠埃希氏菌的分离鉴定 将奶样接种于BHI液体培养基37 ℃过夜培养后，使用接种环蘸取菌液划线于麦康凯琼脂平板和伊红美蓝平板，于37 ℃恒温培养18 h～24 h，观察菌落特征进行初步鉴定；然后将纯化后的疑似菌株于BHI液体培养基过夜培养后进行生化鉴定；最后采用水煮法提取分离菌DNA作为模板，根据文献[10]报道的细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增(表1)。50 μL反应体系包括：2×TaqPCR Master Mix 25 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，最后ddH2O补足50 μL。反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，共35个循环；72 ℃再延伸10 min。PCR扩增产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳30 min，电压120 V，使用紫外凝胶成像分析系统观察结果，并将PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.2.2 耐药性检测 采用K-B纸片扩散法选取氧氟沙星、环丙沙星、链霉素、庆大霉素、头孢唑啉、头孢他啶、阿莫西林、氨苄西林、青霉素G、克林霉素、红霉素、复方新诺明、四环素等13种常用药敏纸片进行药敏试验；从伊红美蓝平板上挑取单菌落接种于BHI肉汤过夜增菌培养后，将菌液浓度调至0.5麦氏比浊管，取200 μL均匀涂布于MH培养基上，然后将药敏纸片分别贴于MH培养基表面，放入培养箱37 ℃恒温培养8 h～12 h，测量抑菌圈直径。药敏结果根据临床实验室标准化协会( CLSI) 制定的标准判定[11]。

1.2.3 毒力基因检测 根据奶牛乳房炎源大肠埃希氏菌携带的主要毒力基因进行PCR检测，参照文献[12-17]中报道的引物序列，合成大肠埃希氏菌毒力基因astA、sepA、escV、hlyA、fyuA、ler、irp2、iucD、eaeA共9对特异性引物，并送上海生工生物工程技术服务有限公司合成(表1)。9种毒力基因PCR扩增反应体系相同，25 μL反应体系：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O补足25 μL。astA、escV基因的PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95℃ 1 min，72 ℃ 30 s，共30个循环；72 ℃再延伸8 min。sepA、hlyA、fyuA、ler、irp2、iucD、eaeA基因的PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共30个循环；72 ℃再延伸10 min。PCR产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳后，经紫外凝胶成像观察，统计结果。

表1 PCR引物信息

1.2.4 小鼠攻毒试验 将48株分离菌分别接种BHI肉汤培养基，于37 ℃恒温振荡培养12 h；试验组每组5只，另取5只做对照组，用生理盐水将菌液稀释至1×109CFU/mL，小鼠禁食禁水12 h后，将试验组小鼠分别腹腔注射攻毒菌液0.5 mL/只，同时将5只空白对照组小鼠注射等量生理盐水，观察24 h～48 h内小鼠发病及死亡情况。

2 结果

2.1 大肠埃希氏菌分离鉴定结果

该分离菌在麦康凯琼脂培养基上生长为红色、有光泽、隆起的菌落(图1)；在伊红美蓝琼脂培养基上生长为黑色带金属光泽的典型菌落(图2)；革兰氏染色镜检均为两端钝圆、成对或散在分布的革兰氏阴性短杆菌(图3)。能分解葡萄糖、乳糖，赖氨酸、鸟氨酸、卫矛醇、靛基质试验多数呈阳性，尿素、硫化氢、苯丙氨酸、西蒙氏枸橼酸盐等试验呈阴性，结果共有48株分离菌符合大肠埃希氏菌生化特性。使用细菌16S rDNA进行PCR扩增，结果在1 500 bp处出现目的片段(图4)，将测序结果经Blast分析，与大肠埃希氏菌的同源性均在99%以上，结果表明48株分离菌均为大肠埃希氏菌。

图1 分离菌在麦康凯培养基上的菌落形态

图2 分离菌在伊红美蓝培养基上的菌落形态

图3 分离菌的染色特性(1 000×)

M.DNA 标准DL 2 000;-.阴性对照；1～23.分离菌株

2.2 耐药性检测结果

使用9大类13种常用抗菌药物对48株大肠埃希氏菌分离株进行药物敏感性试验，结果显示(图5)，分离株对13种抗菌药物均产生了不同程度的耐药性，对青霉素G的耐药率高达85.4%，对克林霉素的耐药率为43.8%，阿莫西林、氨苄西林、头孢唑啉的耐药率均为41.7%，四环素的耐药率在37.5%，氧氟沙星、环丙沙星、庆大霉素的耐药率均为29.2%，链霉素的耐药率为27%，头孢他啶的耐药率为25%，复方新诺明的耐药率为20.8%，红霉素的耐药率较低，仅为12.5%。所有菌株均对3类或3类以上的抗菌药物耐药。

1.青霉素G；2.克林霉素；3.阿莫西林；4.氨苄西林；5.头孢唑啉；6.四环素；7.氧氟沙星；8.环丙沙星；9.庆大霉素；10.链霉素；11.头孢他啶；12.复方新诺明；13.红霉素

2.3 大肠埃希氏菌毒力基因的PCR检测结果

通过PCR对48株大肠埃希氏菌分离菌的9种常见毒力基因进行检测，结果显示(图6)，9种毒力基因共检出了irp2、FyuA、astA、iucD、ler、escV、eaeA7种毒力基因，目的片段大小分别为413、953、111、714、196、544和375 bp，hlyA、sepA基因未检测出；在48株大肠埃希氏菌分离株中，其中有35株共检测出7种毒力基因，总检出率为72.92%(35/48)，检出的毒力基因分别是iucD(35.41%)、FyuA(16.7%)、irp2(16.7%)、astA(16.7%)、escV(4.17%)、eaeA(4.17%)、ler(4.17%)(图7)；且分离株检出的7种毒力基因中，有FyuA+irp2和escV+eaeA+ler2种毒力基因组合，检出率分别为16.67%(8/48)和4.17%(2/48)。

M.DNA 标准DL 2 000;-.阴性对照；1.irp2；2.FyuA；3.astA；4.iucD；5.ler；6.escV；7.eaeA；8.hlyA；9.sepA

1.iucD；2.FyuA；3.irp2；4.astA；5.escV；6.eaeA；7.ler；8.hlyA；9.sepA

2.4 小鼠攻毒试验结果

小鼠腹腔注射攻毒菌液后，出现精神委顿、厌食、被毛蓬松、呼吸急促等症状；试验组小鼠在24 h～48 h内均有死亡，死亡率为60%～100%，对照组小鼠正常；剖检病死小鼠可从肝脏等实质器官中分离到攻毒菌，表明分离菌株均具有致病性。

3 讨论

近年来，由大肠埃希氏菌引起的乳房炎感染比较严重。本试验从7个奶牛场均检测并分离出大肠埃希氏菌，分离率为33.8%(48/142)；Verbeke J等[18]报道的奶牛乳房炎大肠埃希氏菌分离率低于本试验；衡水地区[19]和杭州地区[20]与本试验结果基本一致；而在新疆石河子地区[21-22]的报道中，奶牛乳房炎源大肠埃希氏菌的分离率均低于本试验。大肠埃希氏菌的流行情况可能与不同地区奶牛场的饲养环境条件存在差异性有关。

临床上在治疗大肠埃希氏菌引起的奶牛乳房炎时，主要以抗菌药物为主，但是也导致了菌株耐药性不断增强。药敏试验结果显示，大肠埃希氏菌普遍对青霉素G、克林霉素、阿莫西林、氨苄西林等具有较高的耐药性，对红霉素的耐药率较低，且具有多重耐药性。因此，在临床治疗乳房炎时，应先进行药敏试验，筛选敏感性药物进行该病的治疗。据国外报道[23-24]，奶牛乳房炎大肠埃希氏菌已对青霉素、链霉素、氨苄西林、复方新诺明等多种抗菌药物耐药；石润佳等[25]报道的华北地区乳房炎奶样中分离的大肠埃希氏菌对β-内酰胺类药物和林可酰胺类药物出现了严重的耐药现象，分离株至少耐4种，最多耐19种抗菌药物；张金宝等[26]报道的宁夏地区分离的大肠埃希氏菌对氨苄西林的耐药率为54.69%，对四环素和链霉素等的耐药率为39%，对头孢唑啉和喹诺酮类等药物敏感；马博等[27]报道的新疆石河子地区分离的大肠埃希氏菌对青霉素类和大环内酯类等均产生了较强的耐药性，且耐多种抗菌药物的情况比较普遍。本研究结果表明，新疆部分地区奶牛乳房炎大肠埃希氏菌对临床多种常用抗菌药物产生了严重的耐药性，这可能与不同牛场长期使用抗菌药物或者用药习惯有关，且不同地区大肠埃希氏菌的耐药性存在一定程度的差异性。

由大肠埃希氏菌导致的乳房炎与该菌携带的毒力基因有着重要的联系。本研究对分离出的48株大肠埃希氏菌进行了9种常见毒力基因的检测，共检出7种毒力基因，其中有35株大肠埃希氏菌携带毒力基因，总检出率为72.92%(35/48)，检出的毒力基因分别为irp2、FyuA、astA、iucD、ler、escV、eaeA基因。Suojala L[3]等报道的从奶牛乳房炎分离的大肠埃希氏菌中检测到irp2、iucD、astA、eaeA基因，其检出率低于本研究；张金宝等[26]报道的宁夏地区分离的大肠埃希氏菌中检测到astA、escV、eaeA基因，其检出率高于本研究，而于伟伟等[28]在新疆地区分离的大肠埃希氏菌中，irp2、astA基因的检出率也高于本研究，但iucD基因的检出率远低于本研究；大肠埃希氏菌携带的毒力基因分布可能存在地域性差异。小鼠攻毒试验表明，所有分离株均具有致病性，表明新疆部分地区奶牛乳房炎大肠埃希氏菌的致病性较强。

新疆部分地区乳房炎大肠埃希氏菌感染情况严重，携带iucD、FyuA、irp2、astA、escV、eaeA、ler等毒力基因，且具有较强致病性和多重耐药性。