Enpp2基因的分子特征及其在雌性牦牛不同繁殖阶段生殖器官中的表达

马文斌,王 萌,潘阳阳,王靖雷,张燕燕,高丽青,张 晖,王军乾,余四九,王立斌

(甘肃农业大学动物医学院甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心，甘肃兰州 730070)

胞外焦磷酸酶/磷酸酯酶2(ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 2，ENPP2)又称自分泌趋化因子(autotaxin，ATX)[1]。它由2个N-末端生长激素B样结构域(SMB1和SMB2)、1个中心催化磷酸二酯酶(PDE)结构域和1个C-末端核酸酶样结构域(NUC)组成[2]，是胞外焦磷酸酶/磷酸二酯酶(ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterases，ENPPs)家族中的1种，该家族中只有ENPP2具有溶血磷脂酶D(lysoPLD)活性，能以溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine，LPC)为底物催化生成溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)[3]。LPA是一种胞外信号分子，其通过与6种不同的G蛋白偶联受体(LPA1-6)结合发出信号，这些受体存在于许多不同类型的细胞表面，连接多个下游信号通路[3]。在生物体内发挥着重要作用，如参与细胞增殖、分化和凋亡等许多生理和病理的过程[4]。ENPP2最早是从人黑色素细胞中分离得到的[5]，目前已经证实Enpp2基因在生物体内广泛表达，比如在脑、胎盘和卵巢中都能检测其mRNA的表达。据报道，敲除Enpp2基因后，小鼠在胚胎发育的第9.5天死亡，并证实其在卵黄囊血管形成中发挥重要作用。Ahn H J等[7]检测了大鼠子宫中ENPP2的表达，结果显示在不同发情周期ENPP2的表达量不同；进一步研究发现在小鼠子宫中ENPP2的表达受到雌激素的调控。Seo H等[8]发现在猪发情周期和妊娠期所有阶段的子宫内膜中均检测到ENPP2的表达，并证明ENPP2可能调节LPA的合成，在猪妊娠过程中的建立中发挥着重要作用。Sinderewicz E等[9]研究证明ENPP2在牛卵泡生长发育中具有重要的调节作用。

牦牛(Bosgrunniens)是生活在高海拔的一种特有畜种，对牧区人们的生活起着非常重要的作用，其低繁育率的问题大大地影响了当地经济的发展，也一直以来受到人们的关注。目前，国内外尚无关于ENPP2在牦牛生殖器官中表达和定位的报道。为了探明ENPP2对牦牛生殖活动的调节作用，本研究拟克隆Enpp2基因，并通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白质免疫印迹(Western blot)和免疫组织化学法检测ENPP2在牦牛不同繁殖阶段卵巢、输卵管和子宫中的表达与定位，为进一步探究ENPP2在调节牦牛生殖生理活动中发挥的作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.2 样品采集 选取健康雌性牦牛，年龄4岁～8岁，处于卵泡期(卵巢上有优势卵泡)、黄体期(卵巢上有明显黄体)和妊娠期的牦牛各3头，颈动脉放血处死后，采集卵巢、输卵管和子宫样品。一部分用锡箔包住后放入-196 ℃液氮中保存，用于RT-qPCR、Western blot和基因克隆试验；另一部分放入含40 mg/mL多聚甲醛溶液中固定，用于免疫组化试验。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取及反转录 提取牦牛卵巢、输卵管和子宫的总RNA，并反转录合成cDNA，置-20 ℃保存备用。

1.2.2 引物设计 在GenBank上参考基因序列，牛(Bostaurus)登录号：NM-001080293.1，设计引物。引物序列、退火温度和产物长度等见表1。所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 目的基因及内参基因引物序列

1.2.3 基因克隆 PCR的反应体系为：Taq酶10 μL，模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。反应条件为：94 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，62.3 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s(扩增)，共45个循环；72 ℃ 5 min。产物回收DNA序列，与 pMDTM19-TVector载体连接构建重组质粒，转化至JM109感受态细胞中，加入SOC培养基，37 ℃180 r/min恒温振荡1 h，取120 μL涂于含有Amp、X-gal和IPTG的LB固体培养基上，培养。挑取阳性克隆菌放入有Amp的液体培养基中，37 ℃过夜，将菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.2.4 生物信息学分析 利用NCBI-Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析牦牛Enpp2基因同源性；利用MEGA7.0软件邻域联结法绘制系统进化树；利用NCBI在线软件Open reading frame finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)进行开放阅读框分析；利用在线软件ExPASy Protparam (https://web.expasy.org/protparam)分析理化性质；利用PSIPRED在线软件(http:bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred)预测ENPP2蛋白的二级结构；利用软件SWISS-MODEL(https://swissmodel.ex-pasy.org)预测ENPP2蛋白三级结构；利用在线软件Prots Cale (https://web.expasy.org/protscale)分析蛋白亲疏水性；利用在线软件TMHMMServerV2.0 (http:www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)预测蛋白跨膜区域；利用在线软件Netphos预测磷酸化位点(http:www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos)。

1.2.6 ENPP2蛋白在牦牛生殖器官中的表达

1.2.6.1 总蛋白的提取及变性 低温研磨组织后加入蛋白裂解液，待组织充分裂解后4 ℃、12 000 r/min离心5 min，取上清液与上样缓冲液(4×)按3∶1混合，100 ℃变性10 min，置-20 ℃保存备用。

1.2.6.2 ENPP2蛋白在牦牛生殖器官中的表达 使用60 g/L的分离胶和120 g/L的浓缩胶，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，切出目的条带(115 ku)和内参条带(42 ku)，用0.45 mm PDVF膜转膜，PBST溶液冲洗，50 mg/mL脱脂奶粉4 ℃封闭8h，PBST冲洗。一抗(1∶500)孵育，4 ℃过夜，PBST溶液洗3次，每次10 min：二抗(1∶1 000)摇床37 ℃孵育60 min，PBST溶液冲洗6次，每次10 min。在PDVF膜上滴加ECL化学发光液，避光1 min，在发光仪下扫描PDVF膜，ImageJ分析图像，根据灰度值分析ENPP2的表达量。

1.2.7 ENPP2在牦牛生殖器官中的定位 制作牦牛生殖器官组织切片，烘片6 h，脱蜡，在柠檬酸盐缓冲液中抗原修复；滴加30 mL/L的过氧化氢溶液，37 ℃孵育 10 min，PBS溶液洗3次每次3 min；滴加封闭液(A液)，37 ℃孵育15 min，滴加一抗 (1∶400稀释)，4 ℃孵育过夜，阴性对照加 PBS替代一抗，PBS溶液洗3次，每次3 min；滴加二抗(B 液)，37 ℃孵育15 min，PBS溶液洗3次，每次3 min；滴加C液，37 ℃孵育 15 min；加DAB显色液避光显色；复染、脱水、透明、封片，显微镜(DP71，日本Olympus) 拍照。

2 结果

2.1 牦牛 Enpp2 基因克隆

牦牛Enpp2基因的扩增条带见图1，连接载体测序后与参考序列(NM-001080293.1)相似度为99%。测序结果已提交至NCBI GenBank，基因登录号为MW030285。

M.DNA 标准DL 5 000;1.卵巢；2.输卵管；3.子宫

2.2 生物信息学分析

2.2.1Enpp2基因系统进化树构建 在NCBI Blast比对同源性结果显示，牦牛(Bosgrunniens)MW030285与牛 (Bostaurus) NM-001080293.1、水牛 (Bubalusbubalis) XM-006074703.2、绵羊(Ovisaries) XM-004011866.4、白鳍豚 (Lipotesvexillifer) XM-007451670.1、骆驼 (Camelusdromedarius) XM-031439546.1、马(Equuscaballus) XM-003365623.4、澳洲野犬(Canislupusdingo) XM-035718429.1和狐獴 (Suricatasuricatta) XM-029923366.1的同源性分别为99.03%、97.90%、96.41%、91.86%、90.98%、90.36%、90.03%和89.95% 。使用软件MEGA 7.0 构建牦牛Enpp2基因系统进化树(图2)。

图2 牦牛Enpp2基因系统进化树(★表示本试验克隆)

2.2.2Enpp2开放阅读框分析及基因编码蛋白的理化性质分析 经NCBI在线软件ORF finder分析表明，Enpp2基因ORF全长2 669 bp，总共编码875个氨基酸，分子质量为100 093.77 u，分子式为C4 469H6 832N1 224O1 301S49，理论等电点为是7.14，含20种氨基酸，亮氨酸含量最多(8%)，色氨酸含量最少(1.4%)。带负电荷残基总数108个，带正电荷残基总数107个。该蛋白不稳定指数为56.80，为不稳定蛋白。

2.2.3Enpp2基因编码蛋白的信号肽、磷酸化位点、疏水性及跨膜结构域分析 根据在线软件Prots Cale预测Enpp2基因编码蛋白疏水性结果表明，位于16位的苯丙氨酸疏水性最强，位于827位的天冬氨酸亲水性最强；结果显示该蛋白氨基酸亲水性大于疏水性，为可溶性蛋白。根据在线软件SignalP-5.0 Server预测Enpp2编码蛋白信号肽，证明该蛋白有信号肽，信号肽含量为69.67%。TMHMM Server V 2.0 软件分析显示牦牛ENPP2蛋白有跨膜螺旋，为跨膜蛋白。利用在线软件Netphos预测ENPP2蛋白磷酸化位点分析结果显示，有38个丝氨酸、28个苏氨酸和 12个酪氨酸磷酸化位点大于阈值0.5，可以称为蛋白质激酶磷酸化位点，总共78个磷酸化位点。

2.2.4Enpp2基因编码的蛋白高级结构预测 由在线软件PSIPRED预测牦牛ENPP2蛋白的二级结构如图3所示。在线软件SWISS-MODEL预测ENPP2蛋白的三级结构如图4所示。

图3 牦牛Enpp2基因编码蛋白二级结构预测

图4 牦牛Enpp2基因编码蛋白三级结构预测

2.3 Enpp2基因在牦牛生殖器官中的表达

Enpp2基因在牦牛生殖器官中均有表达(图5)。在卵巢中，妊娠期Enpp2基因的相对表达量明显高于卵泡期和黄体期；在输卵管中，其相对表达量在黄体期最高，卵泡期次之，妊娠期最低；在子宫中，妊娠期的相对表达量有明显低于卵泡期和黄体期。

A.卵巢；B.输卵管;C.子宫;不同小写字母表示差异显著，P<0.05A.Ovary；B.Oviduct；C.Uterus;Different lowercase letters mean significant difference，P<0.05

2.4 ENPP2蛋白的表达

ENPP2在牦牛卵巢、输卵管和子宫中均有表达(图6)。在卵巢中，妊娠期ENPP2的相对表达量明显高于卵泡期和黄体期；在输卵管中，各时期ENPP2蛋白的相对表达量有显著差异，从高到低依次为黄体期、妊娠期和卵泡期；在子宫中，妊娠期ENPP2的相对表达量明显低于卵泡期和黄体期。

A.卵巢；B.输卵管;C.子宫;1、2、3分别表示卵泡期、黄体期、妊娠期;不同的小写字母代表ENPP2蛋白表达差异显著，P<0.05A.Ovary；B.Oviduct；C.Uterus;1，2，and 3 indicate follicular phase，luteal phase，and pregnancy;Different lowercase letters mean significant differences in ENPP2 protein expressions，P<0.05

2.5 ENPP2蛋白在牦牛生殖器官中的定位

ENPP2蛋白在母牦牛卵巢、输卵管和子宫中均有阳性表达(图7)，在卵巢中，妊娠期和黄体期ENPP2主要表达在黄体细胞(CL)，卵泡期主要表达在卵泡膜(TF)和卵泡颗粒层(SG)；输卵管中，各时期表达无显著差异，其主要表达在黏膜上皮(EM)；子宫中，各时期表达无显著差异，主要表达在子宫腺(UG)和子宫内膜(EP)。

A～I为免疫组织化学染色;其中 A-F为阳性表达;G、H、I为阴性对照；A、D为卵巢；B、E为输卵管；C、F为子宫。EM.黏膜上皮；SG.颗粒层；TF.卵泡膜；CL.黄体细胞；EP.子宫内膜； UG.子宫腺；A、B、C、D、E、F中右上角为黑色区域高倍图

3 讨论

本研究成功克隆出了牦牛Enpp2基因，总长度为2 669 bp，共编码875个氨基酸。同源性分析结果为牦牛Enpp2基因与牛的相似度最高(99%)，与狐獴的相似度最低(89%)。Enpp2基因在进化过程中具有与高度保守性，且在种属之间存在差异性。生物信息学推测结果表明Enpp2基因编码的蛋白质有信号肽，Jansen S[10]研究发现ENPP2的N-末端疏水基是信号肽，这与本试验推测的结果一致。本研究结果表明ENPP2蛋白是一种不稳定的可溶性蛋白。研究表明溶血磷脂酶D(lysoPLD)是ENPP2的可溶性形式[11]，与本试验推测结果相一致。牦牛Enpp2基因与牛基因相似度最高，Enpp2基因编码的蛋白有信号肽，是一种不稳定的可溶性蛋白。

本试验研究表明,ENPP2在卵巢妊娠期相对表达量显著高于卵泡期和黄体期，ENPP2在各时期卵巢黄体细胞中有表达。说明ENPP2参与牦牛妊娠的维持。在妊娠期孕酮激素分泌增加，因此ENPP2的表达很可能受到孕酮的正向调节。ENPP2表达定位于牦牛卵巢的卵泡膜和颗粒细胞中，卵泡膜作为卵泡的重要组成部分，在卵泡发生发育发挥着重要作用。Sinderewicz E等[12]和Boruszewska D等[13]研究表明ENPP2在牛卵泡的发生发育过程中起作用。综上推断ENPP2可能参与牦牛妊娠的维持和卵泡的发育。

ENPP2在不同繁殖阶段牦牛输卵管中普遍表达，与前人研究其在黄牛输卵管中的表达结果一致[13]。ENPP2在牦牛黄体期输卵管中表达最高，妊娠期次之，卵泡期最低。在卵泡期，随着卵泡发育，雌激素的合成与分泌逐渐增加，而孕激素在相对较低的水平，输卵管黏膜上皮持续生长、增殖，有少量分泌细胞；在黄体期，伴随黄体的形成，雌激素的分泌下降，而孕激素水平显著上升，此时输卵管黏膜上皮纤毛细胞则会出现去纤毛化现象，分泌细胞明显增多，为运输卵子做准备[14]。ENPP2在牦牛输卵管中的表达部位为黏膜上皮，输卵管黏膜上皮主要由纤毛细胞和分泌细胞组成。Sinderewicz E等[9]研究表明由ENPP2促进生成的LPA可能参与配子的转运、受精和输卵管与卵丘-卵母细胞复合体之间的细胞信号传导。综上所述，ENPP2可能通过LPA参与卵子的运输、受精并与早期妊娠有关，且ENPP2可能受到孕酮激素的正向调节。

子宫是动物孕育胎儿的场所。子宫内膜是子宫中孕育胎儿的重要结构，其具有分泌功能，子宫腺是子宫中的分泌腺，其对胎儿的发育非常关键。免疫组化结果显示，妊娠期ENPP2表达定位于牦牛的子宫内膜及子宫腺中。因此，ENPP2可能在胎儿发育过程中发挥作用。有学者研究发现ENPP2在绵羊和猪子宫中均有表达，本研究发现ENPP2在牦牛子宫中，卵泡期和黄体期表达显著高于妊娠期，与猪[9]子宫中的表达规律基本一致。Seo H等[8]和Boruszewska D等[15]研究ENPP2促进产生的LPA可能在猪及牛胚胎的着床和妊娠的建立中起关键作用，因此，ENPP2可能参与妊娠的建立及胎儿的发育。

本研究成功克隆牦牛Enpp2基因，登录号为MW030285；其ORF全长为2 669 bp，共编码875个氨基酸，此基因表现为高度保守且种属之间存在显著差异；ENPP2蛋白是一种不稳定的可溶性蛋白，具有信号肽。ENPP2在牦牛不同繁殖阶段的生殖器官中均有表达且表达存在差异性。ENPP2蛋白定位在卵泡膜、卵泡颗粒层、黄体细胞、输卵管的生殖上皮、子宫腺、子宫内膜。本研究结果提示ENPP2可能参与卵子的发生发育、运输以及维持妊娠和胎儿的发育。