miR-14对麦冬多糖脂质体调节枯否氏细胞免疫活性的影响

潘兴学，吕一舟，王文丽，麻武仁，刘迎秋，宋晓平，范云鹏

(西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

麦冬为百合科植物麦冬的干燥块根，始载于《神农本草经》，其味甘、微苦，性微寒，具有润肺生津、清热养阴的功效，用于治疗肺燥干咳、喉痹咽痛、阴虚痨嗽、津伤口渴、内热消渴、心烦失眠、肠燥便秘等症，被列为滋阴之要药[1]。麦冬多糖(OP)作为麦冬的主要活性成分之一，具有增强免疫、耐缺氧、抗炎、抗肿瘤、抗氧化等多种药理作用[2]。脂质体是由一个或多个磷脂双分子层组成的球形囊泡，是一种有效的药物载体[3]。脂质体作为药物载体，具有提高药效和生物利用度、降低药物毒性、减少不良反应等优点[4]。研究证明，中药多糖被脂质体包封后能显著增强其免疫活性[4-5]。

MicroRNAs(miRNAs)是一种非编码小RNA分子，由18个～22个核苷酸组成。miRNAs能够在mRNA水平调控靶蛋白的表达[6]。研究证明中药及其有效成分对miRNAs有广泛的调控作用，如黄芪多糖通过调控miR-127保护H9c2细胞免受脂多糖诱导的炎症损伤[7]；当归多糖通过调控miR-223保护PC-12细胞免受脂多糖诱导的损伤[8]。

本试验在前期证明，麦冬多糖制备成麦冬多糖脂质体(OPL)后，能够显著提高其免疫活性[4]，并通过高通量测序法确定miR-14与OPL免疫调节活性相关，但作用机制尚不清楚。因此在本试验中，以枯否是细胞(KCs)为模型，通过Griess、荧光染色、流式细胞术等方法研究了miR-14对OPL调节免疫活性的影响，旨在进一步探究OPL调节免疫活性的作用机制，为新型中药免疫增强剂的研发提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物和细胞 OPL，西北农林科技大学中兽医药实验室前期制备所得；用完全培养基将OPL稀释为125、62.5、31.25 μg/mL 3个浓度，于4 ℃储存备用。小鼠源KCs，购自美国北纳生物公司。

1.1.2 主要试剂 miR-14 mimic、miR-14 inhibitor、mimic negative control(mimic NC) 、inhibitor negative control(inhibitor NC)，广州锐博生物科技有限公司产品；Lipofectamine 2000转染试剂盒，赛默飞世尔科技公司产品；亚硝酸盐测定试剂盒、一氧化氮合成酶(iNOS)分型测试盒，南京建成生物工程研究所产品；FITC-dextran，上海阿拉丁生化科技股份有限公司产品；Hoechst 33258染色液，FITC-OVA北京索莱宝科技有限公司产品；PE-CD14、FITC-MHC Ⅱ，赛默飞世尔科技公司产品；ROS检测试剂盒，碧云天生物技术公司产品；5×Integrated RT Master Mix逆转录试剂盒、2×Fast Real time PCR Master Mixture(Green)荧光定量试剂盒，北京迪宁生物科技有限公司产品；miR-14，U6引物，生工生物工程(上海)股份有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 FACSAriaTM流式细胞仪，美国BD公司产品；Multiskan FC酶标仪，美国Thermo公司产品；CX23倒置显微镜，日本Olympus公司产品；ICX41荧光倒置显微镜，舜宇光学科技有限公司产品；TC-XP型PCR扩增仪，杭州博日科技有限公司产品；CFX Connect荧光定量基因扩增仪，美国伯乐公司产品。

1.2 方法

1.2.1 KCs细胞准备 从液氮罐里取出KCs，置于37 ℃恒温水浴锅中快速融化，加入3 mL完全培养基混匀，1 200 r/min离心8 min后弃上清，PBS洗1遍后加入完全培养基重悬混匀，于37 ℃、体积分数为5%的CO2的细胞培养箱中培养。

1.2.2 Real-time PCR检测转染miR-14 mimic或miR-14 inhibitor后miR-14的表达 将KCs铺于6孔细胞培养板中，在细胞长至30%～40%时，按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书上的步骤，将miR-14 mimic或miR-14 inhibitor以及相应的NC，以50 nmol/L的浓度分别单独转染。继续培养36 h后，用PBS洗2次，向每个孔加入1 mL TRIpure Reagent试剂，按照TRIpure Reagent试剂说明书上的操作步骤进行总RNA的提取，提取的总RNA在5×Integrated RT Master Mix逆转录试剂盒说明书的操作步骤的基础上加入miR-14或U6的反转录引物(表1)合成cDNA。以反转录得到的cDNA为模板(表1)，以miR-14和U6(内参)为引物(表2)，按照2×Fast Real time PCR Master Mixture(Green)试剂盒说明书加反应体系：cDNA 2 μL，2×Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，ddH2O 7.6 μL。反应程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。real-time PCR结果采用2-ΔΔCt法进行分析。

表1 反转录引物序列

表2 PCR引物序列

1.2.3 miRNA转染及OPL处理 将状态良好的KCs铺于细胞培养板中，在细胞长至30%～40%时，按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书上的步骤，将miR-14 mimic或miR-14 inhibitor以及相应的NC，按照50 nmol/L的浓度分别单独转染。转染后继续培养36 h，加入不同浓度OPL(125 μg/mL～31.25 μg/mL)，同时设定miR-14 mimic control和miR-14 inhibitor control，继续培养24 h进行后续试验。

1.2.4 NO和iNOS分泌的测定 收集转染并加OPL处理过的细胞上清液，分为两部分，一部分按亚硝酸盐检测试剂盒说明书进行操作，用酶标仪于550 nm波长处检测吸光度(OD)，最后根据NaNO2标准曲线计算NO浓度。另一部分按照iNOS测定试剂盒说明书，用酶标仪于530 nm波长处检测吸光度，最后根据说明书上的公式计算iNOS浓度。

1.2.5 荧光染色法检测KCs吞噬FITC-dextran的活性 用PBS溶解FITC-dextran，并将浓度调至成1 mg/mL的溶液，4 ℃避光保存。将转染并加OPL处理过的细胞用PBS洗2次，加入FITC-dextran溶液，37 ℃避光孵育1.5 h，PBS洗3次，置荧光显微镜下观测拍照。

1.2.6 荧光染色法检测KCs吞噬FITC-OVA的活性 将FITC-OVA与完全培养基和不同浓度药物组混合(40 μg/mL)，置-20 ℃下过夜。将含有FITC-OVA的药物培养基加入到转染处理过的细胞中，培养24 h。除去培养基，用PBS洗涤细胞2次。将组织固定液添加到每个孔中，4 ℃无光固定10 min。然后用PBS清洗细胞2次，每次3 min。将DAPI(5 μg/mL)加入每个孔中，在37 ℃下培养15 min染核。PBS洗涤细胞2次，每次3 min。荧光显微镜下观察细胞对FITC-OVA的吞噬作用并拍照。

1.2.7 流式细胞术检测KCs表面分子CD14和MHC Ⅱ的表达 将转染并加OPL处理过的细胞PBS洗2次后，用PBS重悬细胞，同时加入荧光标记的抗体(PE-CD14、FITC-MHC Ⅱ)，将细胞悬液置于4 ℃避光30 min，300目网过滤，用流式细胞仪检测细胞表面分子CD14、MHC Ⅱ的表达水平。

1.2.8 Hoechst 33258染色检测细胞凋亡 将转染并加OPL处理过的细胞用PBS洗2次。加入组织固定液，4 ℃固定1 h。去掉组织固定液，PBS洗3次，加入Hoechst 33258染色液时轻摇细胞板，使染色均匀。室温静置10 min。去掉染色液后PBS洗2次。最后每孔加入1滴抗荧光淬灭封片液，置于荧光显微镜下进行观察拍照。

1.2.9 ROS分泌的测定 将转染并加OPL处理过的细胞用PBS洗2次。加入按照1∶1 000无血清培养液稀释的DCFH-DA装载探针。37 ℃细胞培养箱内孵育20 min，每隔5 min轻摇一下细胞板确保探针装载均匀。用无血清细胞培养液洗细胞3次，以充分洗去未进入细胞内的DCFH-DA，再用PBS洗2次，置于荧光显微镜下进行拍照。

1.2.10 细胞划痕检测细胞迁移变化 将转染并加OPL处理过的细胞用PBS洗2次，使用1 mL枪头对细胞划线，PBS清洗剥落的细胞残渣，常规条件下继续培养24 h，显微镜下拍照，使用Image J软件分析0 h和24 h细胞划痕边界距离，24 h的细胞间距减去0 h的细胞间距即为24 h细胞的迁移距离。

2 结果

2.1 转染miR-14 mimic或miR-14 inhibitor对miR-14表达的影响

结果见图1。转染miR-14 mimic后的miR-14的表达显著高于mimic NC组(P<0.05)(图1A)，转染miR-14 inhibitor的miR-14的表达显著低于inhibitor NC组(P<0.05)。结果表明，转染miR-14 mimic促进miR-14的表达，转染miR-14 inhibitor抑制miR-14的表达(图1B)。

A.转染miR-14 mimic后miR-14的表达量；B.转染miR-14 inhibitor后miR-14的表达量A.Expression level of miR-14 transfected with miR-14 mimic; B.Expression level of miR-14 transfected with miR-14 inhibitor

2.2 OPL对NO和iNOS分泌的影响

结果见图2。转染miR-14 mimic后，miR-14 mimic control的NO(图2A)和iNOS的(图2B)分泌均显著低于mimic NC组(P<0.01)，125 μg/mL～31.25 μg/mL OPL组的iNOS的分泌(图2B)均显著高于miR-14 mimic control(P<0.01)。转染miR-14 inhibitor后，miR-14 inhibitor control的NO(图2C)和iNOS(图2D)的分泌均显著高于inhibitor NC组(P<0.01)，125 μg/mL和62.5 μg/mL OPL组的NO的分泌(图2C)显著高于miR-14 inhibitor control(P<0.01)，125 μg/mL～31.25 μg/mL OPL组的iNOS的分泌(图2D)均显著高于miR-14 inhibitor control(P<0.01)。结果表明，转染miR-14 mimic后，NO和iNOS的分泌下降；转染miR-14 inhibitor后，NO和iNOS的分泌上升；OPL能够促进转染miR-14 mimic后的iNOS的分泌以及转染miR-14 inhibitor后的NO和iNOS的分泌。

A.转染miR-14 mimic后NO的分泌；B.转染miR-14 mimic后iNOS的分泌；C.转染miR-14 inhibitor后NO的分泌；D.转染miR-14 inhibitor后iNOS的分泌A.NO secretion in the transfected miR-14 mimic group; B.The secretion of iNOS in the transfected miR-14 mimic group; C.NO secretion in the transfected miR-14 inhibitor group; D.The secretion of iNOS in the transfected miR-14 inhibitor group

2.3 OPL对KCs吞噬FITC-dextran的影响

结果见图3。转染miR-14 mimic后，miR-14 mimic control组的绿色荧光多于mimic NC组，31.25 μg/mL组的绿色荧光多于miR-14 mimic control组(图3A)。转染miR-14 inhibitor后，miR-14 inhibitor control组的绿色荧光与inhibitor NC组差异不显著，62.5 μg/mL组的绿色荧光多于miR-14 inhibitor control。结果表明，OPL能够提高转染miR-14 mimic和miR-14 inhibitor后KCs对FITC-dextran的吞噬活性。

A.转染miR-14 mimic组吞噬FITC-dextran(200×)；B.转染miR-14 inhibitor组吞噬FITC-dextran(200×)A.The group transfected with miR-14 mimic phagocytosis of FITC-Dextran (200×); B.The group transfected with miR-14 inhibitor phagocytosis of FITC-Dextran (200×)

2.4 OPL对KCs吞噬FITC-OVA的影响

结果见图4。转染miR-14 mimic后，miR-14 mimic control组的绿色荧光多于mimic NC组，62.5 μg/mL组的绿色荧光多于miR-14 mimic control(图4A)。转染miR-14 inhibitor后，miR-14 inhibitor control组的绿色荧光与inhibitor NC组差别不明显，62.5 μg/mL和31.25 μg/mL组的绿色荧光与miR-14 inhibitor control无明显差异，125 μg/mL组的绿色荧光多于miR-14 inhibitor control(图4B)。结果表明，OPL能够提高转染miR-14 mimic和miR-14 inhibitor后KCs对FITC-OVA的吞噬。

A.转染miR-14 mimic组吞噬FITC-OVA(200×)；B.转染miR-14 inhibitor组吞噬FITC-OVA(200×)A.The group transfected with miR-14 mimic phagocytosis of FITC-OVA (200×); B.The group transfected with miR-14 inhibitor phagocytosis of FITC-OVA (200×)

2.5 OPL对表面分子CD14和MHC Ⅱ表达的影响

结果见图5。转染miR-14 mimic后，125.25 μg/mL～31.25 μg/mL OPL组的CD14表达量均高于miR-14 mimic control(P<0.01)(图5B)；125 μg/mL组MHC Ⅱ表达量显著高于miR-14 mimic control(P<0.01)(图5C)；转染miR-14 inhibitor后，miR-14 inhibitor control组CD14表达量(图5E)和MHC Ⅱ表达量(图5F)显著低于inhibitor NC(P<0.05)，125 μg/mL组的CD14表达量显著高于miR-14 inhibitor control(P<0.01)(图5E)，OPL 3个浓度组对MHC Ⅱ的表达量均无影响(图5F)。结果表明，OPL对转染miR-14 mimic后CD14和MHC Ⅱ的表达有显著的促进作用，对转染miR-14 inhibitor后CD14表达有显著的促进作用。

A.转染miR-14 mimic流式图；B.转染miR-14 mimic 组CD14的表达水平；C.转染miR-14 mimic组MHC Ⅱ的表达水平；D.转染miR-14 inhibitor流式图；E.转染miR-14 inhibitor 组CD14的表达水平；F.转染miR-14 inhibitor组MHC Ⅱ的表达水平A.Flow cytometric analysis of cells transfected with miR-14 mimic; B.Expression level of CD14 in transfected miR-14 mimic group; C.Expression level of MHC Ⅱ in transfected miR-14 mimic group; D.Flow cytometric analysis of cells transfected with miR-14 inhibitor; E.Expression level of CD14 in transfected miR-14 inhibitor group; F.Expression level of MHC Ⅱ in transfected miR-14 inhibitor group

2.6 OPL对细胞凋亡的影响

结果见图6。转染miR-14 mimic后，125.25 μg/mL和62.5 μg/mL组的细胞状态最佳且无明显的细胞核发白，miR-14 mimic control组的细胞核比mimic NC组的更加致密浓染(图6A)。转染miR-14 inhibitor后，125 μg/mL组细胞状态最好且细胞核发白率较低，miR-14 inhibitor control和inhibitor NC相比，inhibitor NC的细胞核比miR-14 inhibitor control更加致密浓染(图6B)。结果表明，转染miR-14 mimic后细胞的凋亡率上升，转染miR-14 inhibitor后细胞的凋亡率下降。OPL对转染miR-14 mimic或miR-14 inhibitor后的细胞凋亡有明显的抑制作用。

A.转染miR-14 mimic组凋亡水平(200×)；B.转染miR-14 inhibitor组凋亡水平(200×)A.Apoptosis level in the transfected miR-14 mimic group (200×); B.Apoptosis level in the transfected miR-14 inhibitor group(200×)

2.7 OPL对ROS分泌的影响

结果见图7。转染miR-14 mimic后，miR-14 mimic control组的ROS高于mimic NC组，125.25 μg/mL和62.5 μg/mL组的ROS均低于miR-14 mimic control(图7A)；转染miR-14 inhibitor后，miR-14 inhibitor control组的ROS与inhibitor NC组差异不明显，125.25 μg/mL～31.25 μg/mL组的ROS均低于miR-14 inhibitor control(图7B)。结果表明，OPL对转染miR-14 mimic和miR-14 inhibitor后ROS的生成有显著的抑制作用。

A.转染miR-14 mimic组ROS水平(200×)；B.转染miR-14 inhibitor组ROS水平(200×)A.ROS level in the transfected miR-14 mimic group (200×); B.ROS level in the miR-14 inhibitor transfection group (200×)

2.8 OPL对细胞迁移的影响

结果见图8。转染miR-14 mimic后，miR-14 mimic control组与mimic NC无显著差异，OPL 3个浓度组对细胞迁移能力均无影响(图8A)；转染miR-14 inhibitor后，miR-14 inhibitor control组与inhibitor NC无显著差异，31.25 μg/mL组的细胞迁移能力显著低于miR-14 inhibitor control(P<0.05)(图8B)。结果表明转染miR-14 mimic或miR-14 inhibitor后，细胞迁移能力无变化，31.25 μg/mL浓度的OPL对转染miR-14 inhibitor的细胞迁移能力有抑制作用。

A.转染miR-14 mimic组细胞迁移(40×)；B.转染miR-14 inhibitor组细胞迁移(40×)A.Cell migration in the transfected miR-14 mimic group (40×); B.Cell migration in the miR-14 inhibitor transfected group (40×)

3 讨论

KCs是肝脏固有巨噬细胞，来源于骨髓中的单核细胞[9]，占全身巨噬细胞总数的80%～90%，约占肝脏细胞总数的15%[10]。研究证明，普通药物脂质体进入体内后主要被肝、脾网状内皮系统中的单核-巨噬细胞(尤其是肝脏的KCs)摄取，从而激活机体的自身免疫功能[11]。故本试验选择KCs作为细胞模型。

NO的生物学作用广泛，是哺乳动物体内重要的第二信使分子。iNOS是一种非钙依赖的合成酶，主要通过L-精氨酸途径合成NO[12]。NO的半衰期很短，对NO功能的研究以一氧化氮合酶的活性调控为基础[13]。有研究证明中药及其有效成分可以通过调控miRNAs来调节NO和iNOS的分泌，如三七皂苷可以通过调控miR-23a的表达来调节对NO和iNOS的分泌从而调节IRF-1的表达[14]。本试验结果表明，转染miR-14 mimic抑制NO和iNOS的分泌，OPL能够促进iNOS的分泌；转染miR-14 inhibitor促进NO和iNOS的分泌，OPL能够进一步促进iNOS和NO的分泌。由此可推断，miR-14能够调控NO和iNOS的分泌，OPL通过下调miR-14的表达来促进NO和iNOS的分泌。

吞噬是KCs重要的功能之一[15]。吞噬作用是指细胞通过细胞膜表面褶皱和伸出的伪足吞噬病原体等多种致病因子，并通过吞噬溶酶体内的多种水解酶消解和清除病原体，是机体发挥非特异性免疫的主要方式之一[16]。研究证明OPL可以显著提高KCs的吞噬活性[17]。本试验测定了转染miR-14后OPL对KCs吞噬FITC-dextran和FITC-OVA能力的影响，结果表明，转染miR-14 mimic和miR-inhibitor后基本均能提高KCs的吞噬活性，OPL的不同浓度能够进一步促进KCs的吞噬。由此可推断出KCs的吞噬活性不完全受miR-14的调控，OPL可能会通过其它途径促进KCs的吞噬。

CD14是存在于单核细胞等细胞表面的白细胞分化抗原，分子质量约为55 ku，是一种糖蛋白[18-19]，在疾病的发生、发展及转归方面起着重要的作用。MHC Ⅱ位于抗原递呈细胞表面，如巨噬细胞、单核细胞等。KCs是诱导淋巴细胞增殖的主要细胞，且这种诱导作用受MHC Ⅱ类分子限制[20]。研究证明miRNAs参与调控CD14的表达，如转染miR-146a-5p mimic会上调CD14的表达水平，转染miR-146a-5p inhibitor会下调CD14的表达水平[21]。本试验结果显示，转染miR-14 mimic对CD14和MHC Ⅱ的表达没有显著影响，但转染miR-14 inhibitor后能显著抑制CD14和MHC Ⅱ的表达，而OPL能够进一步促进CD14和MHC Ⅱ的表达，表明OPL可能通过下调miR-14来调节CD14和MHC Ⅱ的表达。

荧光染料Hoechst 33258常用于细胞凋亡的检测，Hoechst 33258能少许进入正常细胞，而凋亡细胞由于膜通透性增强，染色体DNA结构发生改变等原因，会导致Hoechst 33258在细胞内积累，从而荧光作用强于正常细胞。研究证明中药及其有效成分会通过调控miRNAs来调节细胞的凋亡，如枸杞多糖通过调控miR-122的表达来抑制H9c2细胞凋亡[22]；黄芪多糖通过调控miR-138来降低大鼠神经干细胞的凋亡来减轻细胞的氧化损伤[23]。试验结果显示，转染miR-14 mimic促进细胞的凋亡，转染miR-14 inhibitor抑制细胞的凋亡，OPL能够抑制转染miR-14 mimic或miR-14 inhibitor的细胞凋亡，表明OPL能够通过下调miR-14的表达来抑制细胞凋亡，与枸杞多糖和黄芪多糖的研究结果相似[22-23]。

ROS被认为是细胞代谢的有毒产物，主要由大多数动物细胞中的线粒体产生，并作为信号分子参与细胞应激期的氧化反应[24]。研究证明中药及其活性成分可以通过调控miRNAs的表达来影响ROS的分泌[25,26]。本试验结果显示，转染miR-14 mimic促进ROS的分泌，转染miR-14 inhibitor后，ROS的分泌无明显变化，而OPL能够抑制转染miR-14 mimic和miR-14 inhibitor后KCs ROS的分泌。表明OPL通过下调miR-14的表达来降低ROS的分泌。

综上所述，OPL能够通过调控miR-14来调节KCs中NO和iNOS的分泌、CD14和MHC Ⅱ的表达、细胞凋亡、ROS分泌，从而发挥免疫活性作用。