新疆边境地区蜱携带梨形虫种类的分子鉴定

仇晓飞，林汉亮，罗 金，马力克·艾则孜，康逢义，倪 军，罗 毅，刘文阁，马 站，任巧云，曹润来，谭阳春，张高峰，刁沛文，王奇林，刘佩雯，关贵全，罗建勋，殷 宏,5，徐庚全，刘光远*

(1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州 730070；2.中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/甘肃省动物寄生虫病重点实验室，甘肃兰州 730046；3.新疆维吾尔自治区动物卫生监督所，新疆乌鲁木齐 830011；4.兰州市经济作物试验推广站，甘肃兰州 730083；5.扬州大学江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009)

蜱(tick)是一种专性吸血的外寄生虫，以括两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类(包括人)的脊椎动物为宿主，可传播诸如病毒、立克次体、螺旋体、埃立克体、巴尔通体、巴贝斯虫、泰勒虫等多种病原体，作为多种人兽共患病病原的传播媒介，对人类健康及畜牧业的发展造成了重大影响[1-2]。据联合国粮农组织(FAO)统计，仅蜱传性血液原虫病给全球畜牧业造成的经济损失，每年高达70亿美元。梨形虫是一种寄生于红细胞中的原生动物，形状类似梨籽，故称为梨形虫[3]。梨形虫通常包括泰勒虫和巴贝斯虫。截止目前，我国报道的泰勒虫主要包括环形泰勒虫(Theileriaannulate)、东方泰勒虫(T.orientalis)、马泰勒虫(T.equi)、中华泰勒虫(T.sinensis)、吕氏泰勒虫(T.luwenshuni)、尤氏泰勒虫(T.uilenbergi)、绵羊泰勒虫(T.ovis)和泰勒虫未定种(Theileriasp.)等；我国报道的巴贝斯虫主要包括双芽巴贝斯虫(Babesiabigemina)、牛巴贝斯虫(B.bovis)、卵形巴贝斯虫(B.ovata)、大巴贝斯虫(B.major)、东方巴贝斯虫(B.orientalis)、粗糙巴贝斯虫(B.crassa)、隐藏巴贝斯虫(B.occultans)、田鼠巴贝斯虫(B.microti)、犬巴贝斯虫(B.caniscanis)、莫氏巴贝斯虫(B.motasi)和巴贝斯虫未定种(Babesiasp.)等。泰勒虫和巴贝斯虫能引起动物和人的泰勒虫病及巴贝斯虫病，统称这两种病为梨形虫病。梨形虫病在临床上一般以急性多见，临床症状为高热、黄疸、贫血、血红蛋白尿或体表淋巴结肿胀[4]。梨形虫病在动物及其产品的国际贸易中非常重要，能给养殖业带来巨大的经济损失。据报道，梨形虫病对世界许多热带和亚热带地区的畜牧业造成了巨大影响[5]，蜱作为其传播媒介，对梨形虫病的发生起着至关重要的作用。

新疆维吾尔自治区(简称新疆)是我国最大的内陆省份，占国土总面积六分之一，位于西北边陲。截至目前，新疆报道的蜱种共有9属45种，且主要传播无浆体、伯氏疏螺旋体、立克次体、梨形虫等病原[6-7]。由于新疆地理位置特殊，与蒙古、哈萨克斯坦等8个国家接壤[5]，增加了外来病原跨境传播的风险。作为中国五大牧区之一，新疆畜产品的国内、国际贸易较为频繁，这为蜱传病原的跨境传播提供了可能[1]，更有可能造成蜱传病在新疆甚至全国蔓延。因此，有必要对新疆沿边境广大地域的蜱传梨形虫的种类及其分布特征进行系统研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 蜱的采集 2019年本实验室在蜱与蜱传病活跃季节的4月份和5月份，对新疆边境地区的喀什市、温宿县、阿合奇县、阿图什市、乌什县、墨玉县、皮山县、阿克苏市(新疆西北边境地区)，伊宁市、新源县、巩留县、霍城县、伊宁县、尼勒克县、察布查尔锡伯自治县、温泉县(新疆北部边境地区)，和布克赛尔蒙古自治县、塔城市、布尔津县、富蕴县、吉木乃县、哈巴河县、青河县、巴里坤哈萨克自治县及奇台县(新疆东北边境地区)25个县(市)的蜱进行采集。

1.1.2 主要仪器设备 生物安全柜(BSC-1304Ⅱ A2型)，苏州安泰空气技术有限公司产品；普通PCR仪(T100型)，美国Bio-Rad公司产品；核酸电泳仪(DYY-12型)，北京六一生物科技有限公司产品；全自动凝胶成像仪(AlphaImager HP型)，美国ProteinSimple公司产品；4℃离心机(5417R型)，德国Eppendorf公司产品；水浴锅(DK-98-П A型)，上海精宏实验设备有限公司产品。

1.1.3 主要试剂 2×EasyTaqPCR Super Mix预混酶，全式金公司产品；PGEMR-T Easy 载体，T4 DNA连接酶，Promega公司产品；Gel Extraction Kit胶回收试剂盒，OMEGA公司产品；DNA标准DL 2 000、大肠埃希氏菌JM109感受态细胞，TaKaRa公司产品；组织DNA提取试剂盒，QIAGEN公司产品。

1.2 方法

1.2.1 蜱的鉴定 将采集到的蜱带回中国农业科学院兰州兽医研究所进行形态学鉴定。

1.2.2 蜱DNA的提取 形态学鉴定后的蜱分别用于基因组DNA的提取。将蜱置于750 mL/L酒精中浸泡5 min，弃洗液后加入适量的PBS，涡旋15 s，重复操作3次。吸水纸吸干蜱表面残留的液体，加入少许液氮充分研磨，参考组织DNA提取试剂盒的操作说明进行基因组DNA提取，获得的基因组DNA置-20 ℃保存备用。

1.2.3 引物设计及PCR扩增 首先采用梨形虫18S rRNA基因通用引物Piro1-S/Piro3-AS对所有样品进行扩增，进一步用套式引物PIRO1-A/ PIRO-B进行目的基因的PCR扩增[8]。反应体系为50 μL：预混酶25 μL，上、下游引物各1 μL，基因组DNA模板2 μL，灭菌去离子水21 μL。反应条件是：95 ℃ 预变性3 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35个循环;最后72 ℃终延伸 5 min。产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测(阳性对照所加模板为实验室已有阳性样品，阴性对照所加模板为灭菌去离子水)。所有检测阳性样品均进行体外克隆、测序。参考OMEGA公司DNA胶回收试剂盒对PCR产物回收。回收的DNA片段与T-easy载体16 ℃过夜连接。连接产物转化至大肠埃希氏菌JM109感受态细胞，将其均匀涂布在含0.1 moL/L IPTG和X-Gal的LB平板上，37 ℃培养过夜。随机挑取单克隆菌斑于LB培养基中进行菌液培养。PCR进行复检，方法如上所述。阳性克隆送公司测序。

1.2.4 序列比对及进化分析 测序正确的梨形虫18S rRNA核苷酸序列与GenBank中已发表的相关序列(表1)进行多序列比对。采用IQ-Tree软件ML法构建系统进化树。

表1 基于梨形虫18S rRNA相关序列信息

2 结果

2.1 蜱的鉴定及分类

本研究对采集的1 516只蜱经过形态学鉴定后，发现共有4属9个种(新疆西北边境地区3属6种、新疆北部边境地区4属5种、新疆东北边境地区2属2种)，分别为革蜱属的森林革蜱(Dermacentorsilvarum)80只、草原革蜱(D.nuttalli)301只、胫距革蜱(D.pavlovskyi)86只、边缘革蜱(D.marginatus)48只，璃眼蜱属的亚洲璃眼蜱(Hyalommaasiaticum)450只、麻点璃眼蜱(H.rufipes)99只、小亚璃眼蜱(H.anatolicum)25只，扇头蜱属的血红扇头蜱(Rhipicephalussanguineus)377只，血蜱属的刻点血蜱(Haemaphysalispunctate)50只(表2)。

2.2 蜱携带梨形虫的种类及分布

经套式PCR扩增与测序分析结果显示，在采集的1 516只蜱中，梨形虫的携带率为27.77%，不同边境地区蜱的梨形虫携带率不同，其中，新疆西北边境地区梨形虫的携带率为25.70%，新疆北部边境地区梨形虫的携带率为37.47%，新疆东北边境地区梨形虫的携带率为18.93%，且皮山县采集的亚洲璃眼蜱梨形虫携带率最高(80%)，霍城县采集的刻点血蜱梨形虫携带率次之(78%)，而在尼勒克县、塔城市、布尔津县、吉木乃县和哈巴河县等地区所采集的蜱中均未检测到梨形虫(表2)。

表2 新疆不同地区蜱携带梨形虫的检测结果

续表2

2.3 梨形虫的进化特征分析

通过Blast序列比对发现，共检测到9种梨形虫，包括3种泰勒虫和6种巴贝斯虫，分别为绵羊泰勒虫(T.ovis)、马泰勒虫(T.equi)、泰勒虫未定种(Theileriasp.)，驽巴贝斯虫(B.caballi)、莫氏巴贝斯虫(B.motasi)、粗糙巴贝斯虫 (B.crassa)、隐藏巴贝斯虫(B.occultans)、犬巴贝斯虫(B.caniscanis)和巴贝斯虫未定种(Babesiasp.)。进化树结果显示，本研究所检测到的虫种均能与各自的种株聚为一支。其中，T.ovis表现出极高多样性的特征，不仅新疆区域内存在多种基因型，而且霍城株与埃及株(№KY494648.1)及意大利株(№MT242575.1)同源性为98%以上，与乌什、墨玉及伊宁等县的同源性较低(图1)。B.occultans富蕴县地方株与阿图什市地方株位于两个不同分支，其中，富蕴县地方株与中国新疆株(№KU723564.1)的同源性达100%，阿图什市地方株与澳大利亚地方株的同源性(№MN726547.1)也达100%(图2)。

图1 新疆不同地区蜱携带的泰勒虫分子进化树

图2 新疆不同地区蜱携带的巴贝斯虫分子进化树

3 讨论

梨形虫是一类蜱传播性血液寄生虫，在全国范围广泛流行，特别是在西部牧区对养殖业造成了巨大的经济损失，严重威胁着养殖业的健康发展。本研究调查显示，新疆边境地区的蜱优势种为亚洲璃眼蜱、血红扇头蜱和草原革蜱，但以上蜱种的分布会伴随气候变化、动物迁徙等因素而发生改变，继而蜱传梨形虫的种类也会相继发生改变，给相关梨形虫病的防控带来了挑战。之前的研究显示，新疆蜱种主要以璃眼蜱属和革蜱属为主[9]，与本研究结果基本一致，但本研究发现血红扇头蜱亦是当前新疆的优势蜱种之一，这可能为绵羊泰勒虫的进一步传播流行提供了条件。

地理位置以及生态环境对蜱的生长繁殖起着决定性作用，可造成蜱传病原不同地区差异的特征。新疆北部边境地区常年气候湿润多雨，多以草地为主，这种环境有利于蜱的生长繁殖，也为蜱传病原的存活创造了有利的条件，因而也造成了蜱传病原携带率高的特点。本研究证实，新疆北部边境地区蜱主要分为4个属的5个蜱种，其梨形虫携带率高达37.47%，高于本研究中27.77%的梨形虫平均携带率。新疆西北边境地区有3个属6个蜱种的滋生，说明这种半干旱地区的气候也适宜蜱的寄生，但这种气候可能导致蜱生长繁殖的高峰期略早于本试验采集蜱的时间(4月份和5月份)，可能是造成该地区25.70%的梨形虫携带率低于北部边境地区37.47%的携带率的原因，但该携带率与本研究中27.77%的梨形虫平均携带率相比几乎相同，仍高于25%，依然不能否认该地蜱梨形虫携带率高的事实。新疆东北边境地区主要包括2个蜱属里的2个种，

该地区梨形虫携带率为18.94%，低于本研究27.77%的平均携带率，且低于另外两个地区，有几地甚至未检测到梨形虫。该地区中几乎所有的地方相比其他两个地区气候寒冷，因此蜱的生长繁殖相对略晚于另外两个地区，这可能是造成该地区蜱梨形虫携带率较低的主要原因，当然，也不排除当地相关防控措施做的较好的可能性。

本研究在新疆边境地区蜱中共检出了9种梨形虫，包括3种泰勒虫(T.ovis、T.equi、Theileriasp.)和6种巴贝斯虫(B.caballi、B.motasi、B.crassa、B.occultans、B.caniscanis、Babesiasp.)，梨形虫虫种的多样性为后期相关疾病的防控带来了挑战。本次检测到的3种泰勒虫，之前在新疆均有过报道，其中T.ovis致病性较弱。本研究发现，T.ovis18S rRNA序列多样性特征明显，霍城株、埃及株及意大利株处于相同的分类地位，其进化程度早于乌什、墨玉及伊宁等地。新病原的输入使得其为适应环境变化而导致基因多样性的出现，这也是造成相同虫种不同基因型的主要原因之一。另一方面，畜禽贸易或动物迁徙亦造成了相同虫株不同地域分布这一特征。此外，在中东等地区出现的Theileriasp.在本次检测中也有检出，说明Theileriasp.已在我国新疆有分布。

巴贝斯虫作为另外一类重要的梨形虫病原，其对家畜和人造成了严重危害。自1982年以来，在中国大陆已经发现巴贝斯虫11种[10]。其中，B.caballi呈世界性分布，在美洲、非洲、亚洲、欧洲、大洋洲均有B.caballi的相关报道[11]。本研究从森林革蜱、草原革蜱、边缘革蜱及亚洲璃眼蜱中也检测到了B.caballi，文献报道革蜱属、璃眼蜱属和扇头蜱属是B.caballi的传播媒介[5]，这与本研究结果一致。B.caballi在待检地区较为普遍，这可能与当地马属动物规模化养殖有着密切的关系。

B.occultans是一种研究尚少的巴贝斯虫，Munir A等[12]于2014年首次在土耳其图兰扇头蜱中检测到B.occultans，Song R等[5]于2017年首次在我国新疆吉木乃县草原革蜱中检测到该虫株。本试验则分别从新疆阿图什市采集的小亚璃眼蜱和富蕴县采集的亚洲璃眼蜱中检测到B.occultans，且分子进化分析表明，新疆富蕴县地方株与中国新疆株(№KU723564.1)同源性达100%，属于同一分类地位，而新疆阿图什市地方株与澳大利亚地方株(№MN726547.1)属同一分支，亲缘关系更近，同源性为100%，而同为新疆区域来源的富蕴县地方株与阿图什市地方株同源性为99.7%，推测亲缘关系较近的不同地方株可能因为环境差异而导致序列个别碱基的突变。该研究结果扩展了B.occultans发生地的范围及感染蜱种的多样性。

B.motasi不仅是一种感染羊的重要蜱传播性梨形虫，而且可感染人，其传播媒介主要为刻点血蜱和囊形扇头蜱[13]。 Hong S H等[14]于2019年从韩国1例死亡病例的人血中检测出巴贝斯虫病，最终鉴定该巴贝斯虫属于B.motasi；本研究在草原革蜱及麻点璃眼蜱中检测到B.motasi。贾娜等[15]于2018年在中国东北地区肩突硬蜱(Ixodespersulcatus)、嗜群血蜱 (Haemaphysalisconcinn)以及蜱叮咬后患者血液中检测到B.crassa。B.crassa是另外一种可能感染人的巴贝斯虫，本次在胫距革蜱中检测到了该虫种。

值得注意的是，本研究从血红扇头蜱、刻点血蜱及麻点璃眼蜱中检测到T.ovis，而之前的报道显示，T.ovis的传播媒介仅为囊形扇头蜱、森林革蜱和小亚璃眼蜱等[16]。本研究还从草原革蜱中检测到B.caniscanis，已有研究证实网蚊革蜱是犬巴贝斯虫的传播媒介[17]。这些尚未证实的媒介体内检测到的相关梨形虫可能为未来新的媒介的发现提供一定的线索，但因本次所采集的蜱均为半饱血或饱血状态，所以也不排除这一结果可能是蜱机械性携带造成的，究竟它们之间是否为实际意义上的生物学传播媒介尚待后续研究证实。

本研究通过对新疆边境地区蜱中携带梨形虫的调查发现，蜱携带梨形虫的情况在当地很普遍，特征明显，携带率较高，且存在同时携带2种梨形虫的现象。因环境或者人为因素造成的蜱种群的改变，可能会引发新病原的流行。新疆边境广大区域作为我国重要的畜牧业发展基地，因其气候的多样性及地理位置的特殊性，致使其蜱传病原具有多样性的特点。本研究结果为新疆边境地区蜱传梨形虫的进一步防控以及相关措施的制定提供了依据。