布氏锥虫Trx-putative和Trx-like的抗氧化功能研究

李 璇，陈虹宇，姜 宁

(沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110161)

非洲锥虫病是由布氏锥虫(Trypanosomabrucei)感染引起的一类人兽共患寄生虫病，是世界卫生组织(WHO)法定报告的寄生虫病，严重威胁人的健康以及畜牧养殖业的发展[1-3]。该病主要存在于撒哈拉以南非洲地区，但近几年由于旅行及工作原因在我国出现了输入性病例[4-5]。人类非洲锥虫病也称昏睡病，是由布氏冈比亚锥虫和布氏罗得西亚锥虫感染引起的，主要症状是嗜睡昏迷，严重者可导致死亡[2]；动物那加那病是由布氏锥虫感染引起，主要症状是贫血、消瘦[3]。

硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)是一类小分子蛋白，分布广泛，主要起氧化还原调节作用。Trx与硫氧还蛋白还原酶和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸共同组成Trx系统。Trx系统是一种重要的抗氧化系统，可以清除寄生虫虫体自身和宿主免疫细胞产生的的活性氧和活性氮，以减少其对虫体的损伤[6]。迄今为止只在布氏锥虫中发现1个Trx，具有氧化还原活性[7]，我们通过生物信息学分析发现,Trx-putative及Trx-like含有与Trx一样的“Tioredoxin-like super family”结构域。因此其具有很高的研究价值，很可能成为新的药物靶点蛋白。基于此，本研究对布氏锥虫Trx-putative及Trx-like的抗氧化功能进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 虫株、质粒和菌株 布氏锥虫427株、pET-28a与pGEX-4T-1表达质粒，本实验室保存； pEASY-Blunt Zero克隆质粒、大肠埃希氏菌Trans1-T1 competent cells和BL21(DE3)competent cells，北京市全式金生物公司产品。

1.1.2 实验动物 Balb/c小鼠，雌性SD大鼠(180 g～220 g)，购自辽宁长生生物公司。

1.1.4 主要仪器 PCR仪、Nanodrop 2000，Thermo公司产品；核酸电泳仪，北京六一生物科技有限公司产品；SDS-PAGE电泳仪，Bio-Rad公司产品；蛋白质转膜仪，宁波心之生物公司产品；细胞压力破碎仪，STANSTED公司产品；乳化机，Wiggen公司产品；酶标仪，TECAN公司产品；荧光定量PCR仪、正置荧光显微镜、倒置显微镜，德国LEICA公司产品；紫外分光光度计，梅特勒-托利多公司产品；金属浴，杭州瑞诚仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物的合成 Trx-putative和Trx-like基因号分别为Tb427.04.2450和Tb427.05.950。利用Primer 5软件设计4对带有酶切位点的引物，引物1和引物3与pET-28a载体连接，引物2和引物4与pGEX-4T-1载体连接(表1)。

表1 引物序列

1.2.2 重组质粒的构建 将布氏锥虫427株接种Balb/c小鼠，传3代，待毒力稳定后收集并纯化虫体，具体操作步骤参见文献[8]。按照Trizol试剂盒说明书提取RNA，使用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。以布氏锥虫cDNA为模板，利用设计的特异性引物通过PCR扩增Trx-putative和Trx-like基因，反应体系为20 μL，包括2 μL cDNA、10 μL 2×Prime STAR Max Premix、1 μL上游引物、1 μL下游引物和6 μL ddH2O。反应程序为：98 ℃预变性2 min；98 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经8 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，使用胶回收试剂盒回收目的片段，并与pEASY-Blunt Zero克隆载体连接，转入Trans1-T1细胞，筛选阳性克隆菌测序，通过双酶切技术将Trx-putative和Trx-like基因分别与表达载体pET-28a和pGEX-4T-1连接，转入大肠埃希氏菌BL21(DE3)细胞，筛选阳性菌测序。

1.2.3 重组蛋白的表达与纯化 将原核表达菌pET-28a/Trx-putative、pET-28a/Trx-like、pGEX-4T-1/Trx-putative、pGEX-4T-1/Trx-like分别划线接种于含有对应抗性的LB固体培养基中培养，挑取单菌落加到含有对应抗性的LB液体培养基中，37 ℃过夜培养，按1∶100的比例扩大再培养，当OD 600 nm值为0.6～0.8时取出菌液，加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG，在22 ℃条件下过夜诱导菌体表达His标签重组蛋白，在16 ℃条件下过夜诱导菌体表达GST标签重组蛋白，收集菌体并超声破碎，使用Ni-Agarose Resin纯化可溶性His标签重组蛋白，使用Glutathione-sepharose Resin纯化可溶性GST标签重组蛋白，纯化的重组蛋白使用PBS透析，再通过SDS-PAGE和Western blot对其进行验证。

1.2.4 特异性抗性血清的制备 用纯化的重组蛋白Trx-putative-His和Trx-like-His分别与弗氏佐剂等体积混合并充分乳化，100 μg/只经皮下多点注射180 g～220 g的雌性SD大鼠，每个蛋白免疫接种3只大鼠。共免疫4次，2次免疫间隔14 d。初次免疫使用弗氏完全佐剂，之后用不完全佐剂。四免后8 d，对SD大鼠尾尖采血，分离血清。

通过间接ELISA检测抗血清效价，将Trx-putative-GST和Trx-like-GST蛋白质分别用包被液稀释至浓度为5 μg/mL，每孔150 μL，加到96孔酶标板中，4 ℃过夜；倒净孔内液体，每孔200 μL PBST，放置4 min，洗3次；每孔150 μL 30 mg/mL BSA，37 ℃封闭2 h后用PBST洗涤；将免疫大鼠血清作为一抗，用PBST进行稀释，稀释比例为1∶250、1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000，阴性组加入健康大鼠血清，空白组加入PBST，每孔50 μL，37 ℃孵育1 h后用PBST洗涤；将辣根过氧化物酶标记的山羊抗大鼠IgG(1∶2 0000)作为二抗，每孔50 μL，37 ℃孵育1 h后用PBST洗涤；每孔100 μL TMB显色液，室温放置15 min，避光操作；每孔50 μL 2 mol/L硫酸，终止显色；用酶标仪测定每孔OD 450 nm值，判定其血清效价，当(待测血清OD 450 nm-空白组OD 450 nm)/(阴性血清OD 450 nm-空白组OD 450 nm)≥2.1时，特异性抗性血清可用于后续试验。

1.2.5 Real-time PCR分析目的基因转录水平 选取Tubulin作为内参基因，设计并合成Trx-putative、Trx-like以及Tubulin基因的real-time PCR引物，引物序列见表1中的引物对5～7。以体内外不同环境培养的布氏锥虫cDNA为模板，利用上述引物进行real-time PCR反应，反应体系为20 μL，包括2 μL cDNA、10 μL 2×SYBR Green酶、0.8 μL 10 μmol/L上游引物、0.8 μL 10 μmol/L下游引物、0.4 μL RoxⅡ和6 μL ddH2O。反应程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。

1.2.6 间接免疫荧光试验 Balb/c小鼠体内培养布氏锥虫数天后，尾尖采血制备血涂片，用免疫组化笔确定试验区域，用冰冷的甲醇固定，PBS洗涤，加入30 mg/mL BSA封闭，37 ℃孵育30 min，一抗为大鼠抗性血清，37 ℃孵育1 h，PBS洗涤，二抗为Alexa Fluor 488山羊抗大鼠IgG，37 ℃，避光孵育30 min，PBS充分洗涤，加入含DAPI的荧光淬灭剂，用荧光显微镜观察Trx-like及Trx-putative蛋白在布氏锥虫体内的分布情况。

1.2.7 胰岛素还原试验 采用DTT/胰岛素还原法测定布氏锥虫Trx-like及Trx-putative蛋白的二硫键异构酶活性，具体操作步骤参见文献[9-11]。反应体系为800 μL，包含665 μL 0.17 mmol/L胰岛素、不同浓度目的蛋白(3.1 μmol/L、6.2 μmol/L)，最后加入13 μL 100 mmol/L DTT启动反应。用酶标仪测量60 min内溶液浊度的变化，间隔2 min记录一次OD 650 nm值。

1.2.8 金属催化氧化试验 采用金属催化氧化法测定布氏锥虫Trx-like及Trx-putative蛋白对超螺旋pUC19质粒的保护作用，反应体系为50 μL，包含终浓度为5 μmol/L的三氯化铁、3.3 mmol/L的DTT以及不同终浓度的Trx-like和Trx-putative(200、400、800 μg/mL)，37 ℃孵育2.5 h，加入200 ng的pUC19质粒，37 ℃再孵育2 h，通过DNA凝胶电泳检测Trx-like和Trx-putative蛋白的抗氧化水平。

1.2.10 统计学方法 采用GraphPad Prism软件和Excel处理数据。两组间差异采用两独立样本t检验。以“P<0.05”为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重组蛋白Trx-putative和 Trx-like的表达与纯化

利用IPTG诱导表达重组蛋白Trx-putative和Trx-like，纯化后的重组蛋白通过SDS-PAGE和Western blot验证，结果与预测大小一致(图1)，且蛋白纯度较高，可用于后续试验。

A.His标签重组蛋白的SDS-PAGE和Western blot;M.蛋白分子质量标椎;1.Trx-putative-His;2.Trx-like-His；B.GST标签重组蛋白的SDS-PAGE和Western blot;M.蛋白分子质量标椎;3.Trx-putative-GST;4.Trx-like-GSTA.SDS-PAGE and Western blot of His labeled recombinant protein;M.Protein molecular weight Marker;1.Trx-putative-His;2.Trx-like-His；B.SDS-PAGE and Western blot of GST labeled recombinant protein;M.Protein molecular weight Marker;3.Trx-putative-GST;4.Trx-like-GST

2.2 Trx-putative和Trx-like基因在布氏锥虫体内的转录水平分析结果

荧光定量PCR分析Trx-putative和Trx-like基因(Tb427.04.2450和Tb427.05.950)在布氏锥虫体内的转录情况，发现在体内、体外环境培养的布氏锥虫内，Trx-putative和Trx-like基因均有转录；Trx-putative基因在体外培养的布氏锥虫中的转录水平显著高于体内培养的虫体(图2A)，差异显著(P<0.05)；Trx-like基因在不同环境培养的布氏锥虫中的转录水平无显著差异(图2B，P>0.05)；Trx-putative和Trx-like基因在同一培养环境下的布氏锥虫中的转录水平差异极显著(图2C-D，P<0.01)，Trx-putative基因的转录水平极显著高于Trx-like基因(P<0.01)。

A.Tb427.04.2450;B.Tb427.05.950;C.体内;D.体外

2.3 间接免疫荧光试验

间接免疫荧光试验观察Trx-putative和Trx-like在布氏锥虫体内的表达位置(图3)，发现Trx-putative和Trx-like在虫体胞质内广泛分布。

图3 Trx-putative和Trx-like在布氏锥虫体内的表达位置

2.4 胰岛素还原试验

采用DTT/胰岛素还原法测定布氏锥虫Trx-putative和Trx-like的二硫键异构酶活性(图4)，Trx-putative可以催化胰岛素的还原，且具有浓度依赖性，Trx-like不具有此功能。

A.Trx-putative;B.Trx-like

2.5 金属催化氧化试验

利用金属催化氧化系统(Metal-catalyzed oxidation system，MCO)测定布氏锥虫Trx-putative和Trx-like对超螺旋pUC19质粒的保护作用(图5)。单独孵育的MCO组分仅会对超螺旋pUC19质粒造成轻微损伤，而在仅有MCO系统和带有牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的MCO系统中，超螺旋pUC19质粒出现完全切割。但是当MCO系统中加入Trx-putative和Trx-like后，显示出对超螺旋pUC19质粒的保护作用。

A.Trx-putative的抗氧化试验;1.未孵育的puc19质粒;2.孵育的puc19质粒;3.puc19质粒中仅加入三氯化铁;4.puc19质粒中仅加入DTT;5.puc19质粒在MCO体系中;6.puc19质粒在MCO体系中加入BSA;7-9.puc19质粒在MCO体系中加入200 、400、800 μg/mL Trx-putative;B.Trx-like的抗氧化试验;1.未孵育的puc19质粒;2.孵育的puc19质粒;3.puc19质粒中仅加入三氯化铁;4.puc19质粒中仅加入DTT;5.puc19质粒在MCO体系中;6.puc19质粒在MCO体系中加入BSA;7-9.puc19质粒在MCO体系中加入200 、400、800 μg/mL Trx-like;NF.Nick form; SF.Supercoil form

2.6 定点突变试验

A.Trx-putative/C62A的SDS-PAGE和Western blot;M.蛋白分子质量标椎;1.Trx-putative/C62A;B.Trx-like/C39A的SDS-PAGE和Western blot;M.蛋白分子质量标椎;2.Trx-like/C39AA.SDS-PAGE and Western blot analysis of Trx-putative/C62A;M.Protein molecular weight Marker;1.Trx-putative/C62A;B.SDS-PAGE and Western blot analysis of Trx-like/C39A;M.Protein molecular weight Marker;2.Trx-like/C39A

利用突变蛋白Trx-putative/C62A和Trx-like/C39A进行胰岛素还原试验，突变蛋白Trx-putative/C62A的二硫键异构酶活性显著降低(图7)。

图7 Trx-putative/C62A蛋白的胰岛素还原试验结果

利用突变蛋白Trx-putative/C62A和Trx-like/C39A进行金属催化氧化试验，突变蛋白仍具有部分抗氧化作用(图8)。结果表明Trx-putative和Trx-like蛋白“-CXXC-”基序中的第2个半胱氨酸并不是其发挥抗氧化功能的决定性氨基酸。

A.Trx-putative/C62A的抗氧化试验;1.未孵育的puc19质粒;2.孵育的puc19质粒;3.puc19质粒中仅加入三氯化铁;4.puc19质粒中仅加入DTT;5.puc19质粒在MCO体系中;6.puc19质粒在MCO体系中加入BSA;7-9.puc19质粒在MCO体系中加入200 、400、800 μg/mL Trx-putative/C62A;B.Trx-like/C39A的抗氧化试验;1.未孵育的puc19质粒;2.孵育的puc19质粒;3.puc19质粒中仅加入三氯化铁;4.puc19质粒中仅加入DTT;5.puc19质粒在MCO体系中;6.puc19质粒在MCO体系中加入BSA;7-9.puc19质粒在MCO体系中加入200、400、800 μg/mL Trx-like/C39A;NF.Nick form;SF.Supercoil formA.Antioxidant test of Trx-putative/C62A;1.puc19 without incubation; 2.puc19 in water and incubated 37 ℃ for 2 h;3.puc19 only with FeCl3;4.puc19 only with DTT;5.puc19 with MCO system;6.puc19 with BSA with MCO system;7-9.puc19 with Trx-putative/C62A(200,400,800 μg/mL)with MCO system;B.Antioxidant test of Trx-like/C39A ;1.puc19 without incubation; 2.puc19 in water and incubated 37 ℃ for 2 h;3.puc19 only with FeCl3;4.puc19 only with DTT;5.puc19 with MCO system;6.puc19 with BSA with MCO system;7-9.puc19 with Trx-like/C39A(200,400,800 μg/mL)with MCO system;NF.Nick form;SF.Supercoil form

3 讨论

寄生虫在其生命周期中不断暴露在被激活的免疫细胞释放的活性氧(reactive oxide species ，ROS)下，当ROS大量释放时，会对脂质、蛋白质、DNA、RNA等分子造成严重损害，导致细胞凋亡甚至坏死[6]。因此，挖掘与锥虫抗宿主氧化损伤有关的蛋白质，有可能为筛选新的药物靶标提供关键信息。目前已知多种蛋白参与这种机制[12-14]，硫氧还蛋白被证实是其中一种[7]，但尚未见很可能起着类似功能的Trx-putative和Trx-like蛋白的研究报道。

本研究从布氏锥虫中鉴定了Trx-putative和Trx-like蛋白。生物信息学分析这2种蛋白的氨基酸序列，发现Trx-putative和Trx-like含有与Trx一样的“Tioredoxin-like super family”结构域，推测这2种蛋白很可能具有与Trx类似的生物学功能。Trx-putative和Trx-like基因在布氏锥虫体内的转录水平分析结果显示，Trx-putative和Trx-like基因在体内外不同环境培养的布氏锥虫内均检测到转录本，但Trx-putative基因在体外培养的布氏锥虫中的转录水平显著高于其在体内培养的虫体，推测推测Trx-putative和Trx-like蛋白可能参与虫体与宿主的相互作用。

Trx-putative和Trx-like基因在同一培养环境下的布氏锥虫中的转录水平差异极显著，且Trx-putative基因的转录水平极显著高于Trx-like基因，推测Trx-putative可能是一种新型的硫氧还蛋白，在布氏锥虫的生命活动中发挥重要作用。间接免疫荧光试验结果显示，Trx-putative和Trx-like蛋白广泛分布于布氏锥虫胞质中，所以研究这两个蛋白对于进一步探究布氏锥虫和宿主的相互作用具有重要意义。胰岛素还原法测定Trx-putative和Trx-like蛋白的二硫键异构酶活性结果显示，Trx-putative能在DTT的催化作用下，使胰岛素中的二硫键被打开，由于B链的聚集使得溶液的浊度增加，从而在650 nm处有强烈的光吸收，并且随着Trx-putative蛋白浓度的增加，酶活性增强。结果证实了Trx-putative具有二硫键异构酶活性，Trx-like蛋白则没有该功能，进一步推测Trx-putative可能就是布氏锥虫的一种新型的硫氧还蛋白。本研究通过体外超螺旋DNA损伤保护试验发现，在MCO系统中，布氏锥虫Trx-putative和Trx-like蛋白均可以保护超螺旋质粒免受氧化损伤，随着蛋白浓度增加，保护效果越强，表明Trx-putative和Trx-like具有保护DNA损伤的作用。已报道硫氧还蛋白具有一段保守的活性区域“-CXXC-”[6]，生物信息学发现Trx-putative和Trx-like也具有一段该活性区域，为了进一步研究Trx-putative和Trx-like蛋白的结构和功能之间的关系，将这两个蛋白保守区域中的第2个半胱氨酸进行点突变，将其突变成丙氨酸[15-16]，结果显示突变蛋白的二硫键异构酶活性显著降低，抗氧化作用减弱。研究结果为进一步筛选有效药物靶标奠定了基础。