2019—2020年河北部分地区鸡源致病性大肠杆菌的血清型及毒力基因分布

张海龙，何云凤，党儒尧，陈 玥，李佩国，李蕴玉

(河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室，河北 秦皇岛 066604)

鸡大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)病是一种引起鸡腹泻、肠炎、轻度至重度败血症等相关的综合征[1]。E.coli通过土壤、空气、食物等多种途径传播[2]，该病分布广、呈世界性流行，常与传染性支气管炎、新城疫等呼吸道疾病及球虫病并发[3]，可感染雏鸡、育成鸡、产蛋鸡、肉鸡等在不同季节发病，具有较高的病死率，是养鸡场最常见的细菌病之一[4-5]。鸡E.coli血清型众多，主要包括O抗原、K抗原、H抗原3种，而O抗原是临床E.coli最主要的血清型抗原，我国鸡E.coli主要流行的血清型为O1、O2、O12、O78、O142，由于不同血清型之间的菌株缺乏交叉免疫，且每个地区流行的优势血清型有所不同，从而无法通过疫苗的免疫获得保护性，给疫苗的研制带来一定的困难[6-7]。E.coli的致病性不仅与动物种属有关，还与自身携带的毒力有关，致病性E.coli基因组可编码黏附素、摄铁系统、溶血素、血清抗性蛋白等多种毒力因子[8]，这些毒力因子在获取编码毒力因子的基因后，相互协作，造成机体各器官的损害[9]，是引起机体发病的罪魁祸首。毒力因子与血清型对于E.coli的致病能力起主导作用。

本研究对2019—2020年从河北部分地区分离的181株致病性E.coli进行血清型、毒力基因的检测，并分析流行特点，为该地区E.coli病的防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源2019-2020年从河北秦皇岛、唐山、石家庄、沧州、邢台等地区的养殖场采集的 225 例疑似E.coli病的病死鸡，其中2019年135份样品，2020年90份样品。无菌采集疑似E.coli病的病死鸡的肝脏、肺脏等组织。E.coli质控菌株ATCC 25922由河北省预防兽医学重点实验室保存。

1.2 实验动物1日龄健康的海兰褐公雏120只购于河北振志家禽育种有限公司。

1.3 主要试剂普通营养琼脂、麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂(EMB)均购自北京奥博星生物技术有限责任公司，DL2000 DNA Marker，2×Taq Marker Mix 购自北京康为世纪生物科技有限公司，E.coli血清型鉴定用O型血清因子购自天津生物芯片技术有限公司，ID32E肠杆菌科生化鉴定试纸条购自生物梅里埃中国有限公司。

1.4 细菌的分离培养与鉴定将病死鸡的肝脏组织无菌划线接种于麦康凯平板上，37℃倒置培养12～18 h,挑取麦康凯平板上粉红色、光滑的单菌落接种于伊红美蓝平板上，37℃培养12 h，挑取伊红美蓝平板上呈黑色、圆形、带金属光泽的单菌落在普通琼脂平板上进行纯化培养2～3次，-20℃保存备用。按生化鉴定试剂条说明书进行生化鉴定。

1.5 菌株的PCR鉴定水煮法进行细菌DNA的提取，参照文献设计16S rRNA的通用引物，引物序列由北京生工合成，上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物：5′-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3′。反应条件为：94℃ 5 min,94℃ 45 s,56℃ 30 s,72℃ 1 min,72℃ 5 min，反应体系：2×Taq PCR Master mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL ，无RNA酶水6 μL。将阳性产物进行测序。

1.6 菌株的血清型检测参照文献[10]的方法，采用O型血清因子进行玻片凝集试验，对分离的181株致病性E.coli(2019年105株、2020年76株)进行血清型检测。

1.7 优势血清型代表株的致病性试验根据分离菌株的血清型结果，筛选出了优势血清型O1、O2、O18、O26、O78，挑选优势血清型代表株各4株，共20株。将分离纯化的菌株培养至对数生长期，采用滴板计数法进行菌落计数，将菌液稀释至终浓度为2×107CFU/mL。将105只7日龄健康雏鸡随机分为21组，每组5只，第1～20组为攻毒组，每只腹腔注射0.20 mL菌液，每株菌接种1组雏鸡；第21组为空白对照组，腹腔注射相同剂量的生理盐水。观察7 d，记录雏鸡的精神状态、食欲情况和死亡情况，对死亡的鸡进行剖检，观察各脏器病理变化，并对其进行分离及鉴定。

1.8 分离菌株毒力基因的检测水煮法提取细菌DNA，以提取的DNA为模板，根据文献[11-12]由北京生物工程有限公司合成毒力基因Vat、astA、hlyF、colv、Ler、eaeA、fimC、papC、sfa、tsh、ompT、Iss、iroN、iucD、iutA、iutB、irp2、fyuA、ECs3703、ECs3737等20对引物，采用 PCR方法进行毒力基因的检测，胶回收分离菌株的PCR扩增产物进行测序，分离菌株的测序结果与GenBank数据库中参考株的基因序列进行同源性分析。

2 结果

2.1 细菌的分离鉴定通过对分离菌株进行分离纯化、染色镜检、生化鉴定、16S rRNA鉴定。结果显示，从采集的225份病料中分离到了181株E.coli，分离率为80.4%，其中2019，2020年分别分离出105，76株E.coli，分离率分别为77.78%，84.45%。革兰染色在显微镜下观察菌株的形态呈两端钝圆、红色短杆状，在麦康凯平板上呈砖红色、光滑、湿润的单菌落(图1A)，在伊红美蓝平板上呈黑色、圆形、带金属光泽的单菌落(图1B)，培养基上的菌株特征与E.coli特征相符。181株分离菌株经ID32E肠杆菌科生化鉴定试纸条鉴定分析，评定结果均符合E.coli生化鉴定标准，符合率为99.50%～99.90%。

A.分离菌株在麦康凯平板上形态特征;B.分离菌株在伊红美蓝平板上形态特征

2.2 分离菌株16S rRNA PCR鉴定181株分离菌株经PCR扩增后，在约1 492 bp处出现目的条带，与预期结果相符。分离菌株测序结果与GenBank数据库中登录的E.coli的参考株基因序列进行比对，同源性在98.8%～99.9%之间，结果表明181株分离菌株均为E.coli。部分菌株的PCR结果如图2。

M.DL2000 DNA Marker;1～4.临床分离部分菌株的PCR扩增结果;5.阴性对照

2.3 分离菌株血清型检测结果用E.coli标准O型血清因子进行玻片凝集试验检测分离菌株的血清型，结果显示 181株致病性E.coli共有18种不同的血清型，以O78、O1、O2、O18和O26为主要流行的血清型，分别占比14.92%，14.36%，11.60%，10.50% 和10.50%。其中2019年105株致病性E.coli，94株定型，11株未定型，以O26、O1、O18、O78和O2血清型为主，检出率分别为18.10%，14.29%，12.38%，9.52%和7.62%；2020年76株致病性E.coli，71株定型，5株未定型，以O78、O2、O1、O6和O18血清型为主，检出率分别为22.37%，17.11%，14.47%，7.89%和7.89%(表1)。

表1 鸡源致病性E.coli血清型检测结果

2.4 致病性试验结果攻毒组的雏鸡发病率为100.00%，总病死率高达82.00%，部分鸡在攻毒后6 h开始出现打蔫、精神不佳、食欲下降，死亡7只，攻毒后12～24 h，鸡开始拉黄白色稀粪、羽毛粗糙不光滑，死亡42只，攻毒后36～48 h，死亡21只，72 h后，共计死亡82只，总病死率为82.00%，少数攻毒未死亡的鸡也有明显E.coli的发病症状。对病死鸡进行解剖，发现肝脏肿大无弹性、气囊浑浊，心脏包膜增厚。无菌采集病死鸡的肝脏、肺脏等组织，在鉴别培养基上进行分离鉴定，结果显示，分离出的菌是E.coli。对照组的鸡采食、饮水、排泄均正常，无死亡。

2.5 分离菌株毒力基因检测通过PCR方法检测20种毒力基因的携带情况，结果显示，181株致病性E.coli携带16种不同毒力基因，未检测到Ler、eaeA、papC、sfa4种毒力基因(图3)。

2019年105株致病性E.coli中iutA毒力基因检出率最高，为96.19%(101/105)；其次为iroN、hlyF、ompT、Iss、fimC和Ecs3703毒力基因检出率也较高，分别为93.33%，91.43%，90.48%，87.62%，85.71%和83.81%；Vat、iutB、fyuA、colv、tsh、irp2、iucD、astA和Ecs3737毒力基因检出率为7.62%～76.19%。2020年76株致病性E.coli中hlyF毒力基因检出率最高为100.00%；iucD、Iss、ompT和fimC毒力基因检出率分别为93.42%～98.68%；Vat、iutB毒力基因检出率较低，分别为2.63%和23.68%(表2)。

M.DL2000 DNA Marker;1～16.Vat,hlyF,fimC,ompT,Iss,iroN,iucD,iutA,iutB,irp2,fyuA,tsh,colv,astA,Ecs3703,Ecs3737;17.空白对照

表2 2019-2020年鸡源致病性E.coli毒力基因检测结果

多重毒力基因检测结果显示，181株致病性E.coli均携带多种毒力基因，其中2019年的105株E.coli同时携带2～15种毒力基因，其中携带2,3和5种基因的菌株各有1株(0.95%)；携带11种基因的菌株数最多，高达20株(19.05%)；2020年的76株E.coli同时携带4～15种毒力基因，其中携带4，7，8和15种毒力基因的菌株最少，均为1株(1.32%)；携带13种毒力基因的菌株数最多，高达16株(21.05%)(图4)。

图4 2019-2020年致病性E.coli多重毒力基因携带情况

2019年的105株E.coli主要携带5种毒力谱，hlyF+fimC+ompT+Iss+iroN+iucD+iutA+colv+tsh+irp2+fyuA+ECs3703+ECs3737+astA毒力谱检出率最高，为9.52%，其次是hlyF+fimC+ompT+Iss+iroN+iucD+iutA+ECs370+ECs3737+astA毒力谱检出率为7.62%，而hlyF+fimC+ompT+Iss+iroN+iucD+iutA+colv+tsh+ECs370+ECs3737+astA+iutB和hlyF+fimC+ompT+Iss+iroN+iucD+iutA+colv+tsh+irp2+fyuA+ECs370+ECs3737毒力谱的检出率均是4.76%。2020年的76株E.coli主要携带4种毒力谱，其中hlyF+fimC+ompT+Iss+iroN+iucD+iutA+colv+tsh+irp2+fyuA+ECs370+ECs3737+astA毒力谱检出率最高，为9.21%，而hlyF+fimC+ompT+Iss+iroN+iucD+iutA+tsh+irp2+fyuA+ECs370+ECs3737+astA和hlyF+fimC+ompT+Iss+iroN+iucD+iutA+ECs370+ECs3737+astA+iutB毒力谱的检出率均是5.26%，hlyF+fimC+ompT+Iss+iroN+iucD+iutA+colv+tsh+irp2+fyuA+ECs370+ECs3737+astA毒力谱连续2年的检出率均最高，是2019—2020年最流行的毒力谱(表3)。

表3 不同年份E.coli的主要毒力谱分布

3 讨论

3.1 河北部分地区鸡源致病性E.coli的血清型分析E.coli血清型种类有百余种，不同地区所流行的血清型有所差异，其所导致的致病能力也各不相同。申子平等[13]对贵阳、遵义地区分离的39株E.coli进行血清型鉴定，结果显示39株E.coli有8株未定型，其余的31株以O78、O15和O45为优势血清型，分别占比29.03%，12.90%和12.90%。李蕴玉等[14]对秦皇岛地区20株E.coli进行血清型鉴定，结果显示20株E.coli分属于O1、O2、O78、O18和O89血清型,分别占比40.00%，30.00%，15.00%，10.00%和5.00%。本研究通过对河北地区的181株致病性E.coli进行血清型鉴定，发现165株E.coli定型，16株未定型，以O78、O1、O2、O18和O26为主要流行的血清型，分别占比14.92%，14.36%，11.60%，10.50%和10.50% 。由此表明致病性E.coli的优势血清型与所在区域存在很大的联系。

3.2 河北部分地区鸡源致病性E.coli的毒力基因分析禽致病性E.coli不仅含有多个毒力因子，并且不同的毒力因子在E.coli中的流行有较大的差异，致病性E.coli侵入机体后，由于不同的毒力因子相互组合，共同作用而导致发病。刘璨颖等[15]对广东佛山地区的108株禽致病性E.coli进行9种毒力基因的检测，结果表明分离菌株的iucD毒力基因检出率最高，为74.07%(80/108)，其次Iss、tsh和hlyF毒力基因的检出率为55.56%～62.96%，而papC和vat毒力基因检出率较低，分别为5.56%和2.78%。卢琴等[16]报道的湖北部分地区的33株禽E.coli的fimH毒力基因检出率最高，为87.88%，iroD、iucD和estA的检出率为36.37%～57.58%，而ibeA基因检出率为0%。本研究结果表明2019年的iutA、iroN、hlyF、ompT、Iss、fimC和Ecs3703的检出率较高，为83.81%～96.19%，Vat、iutB的检出率分别为7.62%和34.29%；2020年的hlyF毒力基因检出率最高为100%；iucD、Iss、ompT和fimC毒力基因检出率分别为93.42%～98.68%；Vat和iutB毒力基因检出率较低，分别为2.63%和23.68%，而Ler、eaeA、papC和sfa未检出。王俊丽等[17]对聊城地区的212株E.coli进行18种毒力基因的检测，发现分离菌株均携带多重毒力基因，155株分离菌携带5～9种毒力基因，比例为73.11%。杨娟等[18]对昆明地区的140株鸡源E.coli进行12种毒力基因的检测，发现140株E.coli均携带多种毒力基因，同时携带5种毒力基因的菌株有7株，比例为5%，携带8～11种毒力基因的菌株有102株，比例为72.86%。本研究结果表明分离菌株均携带多种毒力基因，2019年的105株E.coli携带11种基因的菌株数最多，高达20株(19.05%)，2020年的76株E.coli携带13种毒力基因的菌株数最多，高达16株(21.05%)。以上结果表明不同地区E.coli所携带的毒力基因种类和数量差异较大，不同地区的E.coli均携带多重毒力基因。本研究对该地区鸡源致病性E.coli的血清型和毒力基因的流行趋势进行研究，为研制该病的疫苗提供了数据支持，为防治鸡源E.coli病提供了理论依据。