药用植物类黄酮生物合成调控的研究进展

卜红宇，韩 峰，郝美玲，王昆鹏，刘炳茹

(内蒙古药品检验研究院，内蒙古自治区 呼和浩特 010020)

黄酮化合物是具有C6-C3-C6基本骨架，以结合态(黄酮苷)或自由态(黄酮苷元)两种形式存在，大部分黄酮化合物以结合态(黄酮苷)形式存在食源性植物[1-4]以及药用植物中，如甘草[5]、山牛蒡[6]、穿心莲[7]、木蝴蝶[8]等，可分为黄酮、黄酮醇、异黄酮、黄烷酮、黄烷醇、花色素[9]。具有抗氧化性[1，2，10]、抗菌[3，11]、消炎[4，11]、抗癌症[11]及抑制心血管疾病等生物功能[12]。本文主要阐述类黄酮生物合成的基因调控及环境胁迫。植物类黄酮生物合成调控的研究对黄酮类化合物生物合成的功能基因挖掘和分子调控机制的阐明具有重要的理论意义，对类黄酮产物合成与积累具有重要的现实意义。

1 植物类黄酮的代谢合成途径

目前，拟南芥[13]等植物中黄酮化合物合成途径已经被阐述清楚，主要涉及苯丙烷生物合成途径，苯丙氨酸在苯丙氨酸酶(PAL)、肉桂酸4-羟化酶(C4H)及4-香豆酰辅酶A连接酶(4CL)等的作用下形成香豆酰辅酶A。底物进一步在查尔酮合酶(CHS)的作用下形成查尔酮，然后分别由查尔酮异构酶(CHI)、柚皮素经黄烷酮3-羟化酶(F3H)、类黄酮3′-羟化酶(F3′H)和类黄酮3′，5′-羟化酶(F3′5′H)等酶作用生成黄酮类化合物。黄酮类化合物的生物合成是一个复杂的过程，不仅涉及苯丙烷的生物合成途径，还涉及许多其他的次生代谢途径，如黄酮代谢途径、萜类生物合成途径、植物激素信号转导途径、植物昼夜节律途径、淀粉和蔗糖代谢途径[5]。

2 植物类黄酮生物合成途径中的调控基因

2.1 CHS酶及基因

1983年首个植物荷兰芹的CHS 序列被发现[14]，之后蕨类[15]以及苔藓[16]等多种植物中CHS基因也已被克隆。CHS是黄酮类化合物合成途径中的第1个关键酶和限速酶，其结构简单，被认为是蛋白质工程的理想靶点[17]。它催化该途径的第1步，即将3分子丙二酰辅酶A和1分子4-香豆酰辅酶A结合形成查尔酮，进一步衍生转化为各类黄酮类化合物[18]。然而，CHS也催化产生其他多酮类化合物，如香豆酰三乙酸内酯，CHS催化的这种不确定性对类黄酮生物合成的效率产生了不利影响，Waki 等人[19]研究表明，由陆地植物基因组中普遍存在的基因编码的查尔酮异构样蛋白(CHILs)与CHS结合，可以减少香豆酰三乙酸内酯的形成，从而纠正CHS混杂的催化作用。这种CHILs功能已在多种陆地植物中得到证实，是一种促进底物从苯丙烷途径有效进入黄酮途径的保守策略。拟南芥的CHS基因调控其类黄酮的积累和非生物胁迫耐受性[20]。

2.2 CHI酶及基因

CHI是黄酮类化合物代谢途径中的第2个关键酶。目前，黄芪[21]、凹唇姜[22]、青蒿[23]等多种植物CHI基因被成功克隆。Sun等人[24]研究表明CHI是蛇根草花青素生物合成的关键酶。Ren 等人[25]从红花cDNA文库中克隆了一种新的CHI基因，命名为CtCHI-N，其表达与开花期黄酮类生物合成有关。Yang等人[26]克隆了药用植物漆树的CHI基因，命名为RcCHIc，其DNA序列为1058 bp，包含一个内含子和两个外显子，组织中总黄酮水平与RcCHIc mRNA的组织特异性表达呈正相关。而Dare 等人[27]研究表明苹果中CHI过量表达降低了根皮苷的合成与积累。

2.3 F3H酶及基因

Martin等人[28]首次分离出F3H基因，F3H是黄酮类化合物代谢途径中关键酶之一，是花青素生物合成所必需的关键酶[29]。Cheng 等人[30]研究了洋甘菊中F3H家族(CnF3Hs)4个成员基因CnF3H1-4，发现CnF3H1-4与其他植物F3H相似性较高，所有基因均包含两个保守的结构域，在类黄酮代谢中起重要作用，在不同组织中的表达存在显著差异，CnF3H1-3在花中的表达量最高，而CnF3H4在根中的表达量最高。夏堇中F3H基因的表达影响其花瓣的颜色，表达量增加时，白色花瓣可变为粉红色[31]。郑晟等人[32]成功克隆了柠条锦鸡儿的F3H基因，命名为CkF3H，其基因序列与其它植物F3H有较高的一致性。CkF3H在根、茎和叶中均有表达，没有组织特异性；CkF3H的表达受低温、高温、干旱和高盐胁迫的诱导，并且在低温胁迫下，CkF3H的表达还受到光周期的影响。

2.4 DFR酶及基因

二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)是花青素合成途径的关键酶，其选择性的催化二氢杨梅黄酮、二氢山奈黄酮醇、二氢槲皮黄酮生成无色飞燕草色素、无色天竺葵色素和无色矢车菊色素[33]。DFR基因具有组织表达特异性，李媛等人[34]从乌头花中克隆了DFR基因，命名为AcDFR，其cDNA全长为1233bp，开放阅读框为1014bp，预测编码337个氨基酸；AcDFR在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)结合区域和底物结合区域都高度保守，属于NADB Rossmann超家族。AcDFR主要在乌头的花中表达，在根、茎、叶中几乎不表达，其表达量与花青素含量的变化呈正相关。孙海燕等人[35]从三色堇花瓣中克隆了1个花色素合成结构基因，命名为VwDFR，其cDNA全长为1340 bp，编码347个氨基酸，与胡杨的DFR序列具有较高的一致性。VwDFR 蛋白含有典型的植物DFR蛋白的保守功能结构域，属于短链脱氢/还原酶(SDR)超基因蛋白家族成员。VwDFR 基因在三色堇不同组织中的表达存在明显差异，在初花期的花瓣中表达量最高，且色斑区高于非色斑区。Ni 等人[36]从银杏中分离出3个新的DFR基因(GbDFR)，这些基因具有相似的结构，与拟南芥DFRs的关系比之前文献中报道的GbDFR更为密切；GbDFR4和GbDFR6分别在叶片和果实中优先表达；幼龄和成熟期叶片基因表达模式相似，5月份收获的果实中GbDFRs的表达水平显著高于6月份收获的果实。Mei 等人[37]在茶树中鉴定出DFR编码基因(命名为CsDFRa)，并研究了它和另外5个推测的在最近的组学文献中得到广泛讨论的DFR(命名为CsDFRb1、CsDFRb2、CsDFRb3、CsDFRc和CsDFRd)的功能，结果表明5个推测的CsDFRs序列与CsDFRa存在较大差异，且表达水平较低，只有CsDFRa在产生花青素和儿茶素的途径中起作用。但141位单氨基酸突变修饰了CsDFRa对二氢槲皮素和二氢杨梅素的调控，也削弱了其稳定性。

2.5 其它酶及基因

黄酮类化合物的生物合成是一个非常复杂的过程，许多对生物合成至关重要的酶及基因还有待不断研究。如最新研究发现葡萄糖苷酶基因(GLU)、松柏醛脱氢酶基因(CADH)和过氧化物酶基因(POD)表达的下调使生物合成底物向类黄酮合成途径分流[5]。番茄红素合酶基因(CS1)表达的下调可能有利于类胡萝卜素的生物合成，促进类黄酮的积累[38]。Wang等人[39]研究表明，花青素合成酶(ANS)与黄酮醇合酶(FLS)、F3H都属于依赖2-氧化戊二酸(2ODD)氧合酶家族，在类黄酮的生物合成中发挥着重要的作用。从烟草基因组中鉴定了2个ANS基因、2个FLS基因和4个F3H基因。编码烟草2ODD氧合酶的基因在黄酮类生物合成中并不能决定黄酮类化合物在各组织中的积累模式，但会强烈影响烟草组织中黄酮类化合物的浓度。当ANS基因被抑制，更多的碳源流向黄酮醇生物合成，而当FLS基因被抑制时，花青素积累更多。王毅等人[40]从滇牡丹中成功克隆了类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶(F3GT)基因，命名为PdF3GT1，其在花蕾，花瓣中大量表达，在叶和花芽中有微弱表达；在根和茎中没有表达。肖继坪等人[41]研究发现花色苷的积累与F3GT的表达正相关，F3GT相对表达量和花色苷含量均是块茎高于叶片，花色苷含量较高的器官，其F3GT 的相对表达量也较高。Hu 等人[5]从甘草中挖掘出了61个对黄酮类化合物合成起着重要作用的基因。克隆出AH、DXS、LUP、CHS以及SQS基因，然而对于这些基因中的大部分，它们在高植物类黄酮生产中的作用尚不清楚。

3 环境因子对植物类黄酮的调控

3.1 光照

光是植物生命活动中最重要的环境因子之一，它是植物生长发育的能量来源，同时在调控植物的生长发育和次生代谢产物的合成有重要影响。光照包括光强和光质，这两方面都对黄酮的合成有重要影响。光照强度会影响植物中类黄酮含量和分布，一般光照强度增强，植物体内类黄酮含量会升高。不同光质触发植物体内不同的光受体，进而调控植物的生长发育和次生代谢活动，光受体包括光敏素、蓝光/近紫外光受体、紫外光受体，一般情况下，短波段光对植物类黄酮的积累有促进作用，长波光则抑制。Neugart等人[42]研究了温室中光强对甘蓝叶中类黄酮的变化，强光400 μmol·m-2·s-1处理下总黄酮含量比弱光100 μmol·m-2·s-1处理下高23.9%。UVB辐射处理能够诱导葡萄果实皮的黄酮类化合物的积累[43]。UVB照射能够增加银杏黄酮的含量，降低花青素的含量和GbDFR的表达水平[36]。

3.2 温度

低温可以促进植物黄酮合成途径中相关酶的活性，对植物类黄酮的积累有促进作用。张刚等人[44]研究了不同生长温度对烟叶生长发育过程中黄酮类化合物芸香苷和山奈酚-3-O-芸香苷含量、代谢相关酶活性及相关基因表达的影响。研究发现较低的生长温度(18.5℃)有利于黄酮类化合物在烟草叶片中的积累，与生长在较高生长温度(23.5℃和28.5℃)下的叶片相比，较低生长温度上调了烟草叶片类黄酮代谢相关基因 PAL、C4H、4CL、CHS、F3H、F3′H 和 FLS 的基因表达，提高了类黄酮代谢关键酶 PAL、C4H、4CL 和 CHI 的活性，促进了黄酮类化合物芸香苷和山奈酚-3-O-芸香苷的积累。

3.3 水分

适宜的水分胁迫可以促进植物类黄酮的积累。土壤水分、大气相对湿度增加利于总皂苷积累，不利于总黄酮积累。李光跃等人[45]研究发现黄芪根、茎、叶中毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷4种黄酮类化合物在黄芪各器官中分布和含量不尽相同，同一器官中不同黄酮类化合物对干旱胁迫的响应规律也存在差异；适度的干旱胁迫能够促进黄芪毛蕊异黄酮葡萄糖苷的积累，但过度干旱胁迫则不利于其积累。Yang 等人[46]研究发现干旱能够胁迫诱导柴胡叶片中黄酮类化合物和根中柴胡皂苷的生物合成。

3.4 其他

4 展望

近年来，随着对植物类黄酮生物代谢合成研究的逐渐深入，植物黄酮的合成代谢途径已经被阐明，调控结构基因的调控因子也被逐渐分离鉴定，这些研究阐述了黄酮合成的复杂性与特异性。然而，黄酮类化合物的生物合成调控机制十分复杂，许多对生物合成至关重要的酶、基因及调控因子还有待不断研究。随着蛋白组、基因组和转录组分析技术在探索植物次生代谢的分子机制方面的发展与成熟，研究植物代谢调控差异蛋白，关键酶及基因等，有望成为调控植物发育、改变类黄酮含量和/或组成的有效途径。另外也能够为植物类黄酮生物合成的功能基因挖掘和分子调控机制的阐明提供理论基础。