超声辅助提取藜麦黄酮工艺优化及抗氧化性

程丽娜，吴子威，吴榕珍，朱孔飞，宋茹*

浙江海洋大学食品与药学学院（舟山 316022）

藜麦（Chenopodium quinoa Willd）又称南美藜、藜谷等，属于藜科植物。藜麦不仅蛋白质含量高，而且富含不饱和脂肪酸、类黄酮、维生素、酚类及钙、铁、锌、铜等多种有益物质，被联合国粮农组织（FAO）认定为唯一一种单体植物就可以满足人体基本营养需求的食物，也是最适宜人类的一种全营养食品[1-2]。黄酮类化合物是植物中一种重要的次生代谢产物，研究已证实黄酮类化合物在心血管病防治、病毒预防、肿瘤缓解治疗、自由基清除、免疫调节等方面具有生理活性[3-4]。在植物性活性成分提取中，利用超声波产生的强烈空化效应可使液体发生共振[5]，能加速植物细胞壁破裂，从而加速胞内活性组分的快速溶出[6]。因此，超声辅助提取法与传统溶剂萃取法相比，具有提取时间短、提取温度低、提取效率高、经济效益好等优点[7]，在生物活性物质提取中应用广泛。研究以红藜麦为原料，采用超声辅助水提取法提取藜麦中黄酮类化合物，在单因素试验研究基础上，通过响应面试验优化获得最佳提取条件，并对藜麦黄酮类化合物的抗氧性进行初步评价，旨在探索一种绿色环保、高效的藜麦黄酮类化合物提取方法，为藜麦功能型产品的开发奠定前期研究基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

红藜麦，山西省静乐县田园农业综合开发有限公司；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·），北京索莱宝科技有限公司；总抗氧化能力（T-AOC）测试盒，南京建成生物研究所；芦丁：国药集团化学试剂有限公司；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇：均为国产分析纯，生工生物工程（上海股份有限公司）。

1.2 主要仪器与设备

TP-214电子天平（丹佛仪器有限公司）；XMTD-0.25000恒温水浴锅（上海申胜生物技术有限公司）；TGL-16G高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；721可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；KQ5200E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TM-767搅拌机—专业沙冰调理机（中山市海盘电器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 芦丁标准曲线制作[8]

准确称取2.5 mg芦丁标准品，用体积分数为70%乙醇溶解，然后定容至25 mL。吸取0，1，2，3，4和5 mL上述芦丁溶液于10 mL容量瓶中，加入0.3 mL 5% Na2NO3溶液，混匀后静置6 min，加入0.3 mL 10%Al(NO3)3溶液，混匀后静置6 min，然后加入2 mL 4%NaOH溶液，用70%乙醇溶液定容至10 mL，静置15 min，测定510 nm处吸光度。以芦丁质量浓度（mg/mL）为横坐标（x），吸光度为纵坐标（y），绘制标准曲线，如图1所示。

图1 芦丁标准曲线

1.3.2 样品预处理

将红藜麦粉碎，按照质量加入5倍体积石油醚，室温下浸提24 h进行脱脂处理，过滤，将脱脂后藜麦放55 ℃烘箱干燥至恒重，分装至密封袋中，备用。

1.3.3 超声辅助提取藜麦黄酮类化合物影响因素

以藜麦黄酮类化合物提取量（mg/g）为考查指标，蒸馏水为提取剂，研究藜麦粉碎孔径（0.150，0.180，0.250，0.425和0.850 mm）、料液比（1∶25，1∶50，1∶75，1∶100和1∶125 g/mL）、超声提取温度（40，50，60，70和80 ℃）和超声提取时间（20，30，40，50和60 min）对藜麦黄酮类化合物提取量的影响。

1.3.4 藜麦黄酮类化合物含量测定

参考张永花[9]方法，并适当修改。取1 mL提取液，参照1.3.1标准曲线制作方法，测定510 nm处吸光度，根据芦丁标准曲线计算出提取液中黄酮类化合物质量浓度（mg/mL），按照公式（1）计算黄酮类化合物含量。

式中：C为提取液中黄酮类化合物质量浓度，mg/mL；N为提取液稀释倍数；V为提取液体积，mL；m为样品质量，g。

1.3.5 响应面优化试验设计[10]

在单因素试验基础上，固定料液比为1∶100（g/mL），选择藜麦粉碎孔径（A）、超声提取温度（B）和超声提取时间（C）进行三因素三水平Box-Behnken响应面试验，以藜麦黄酮类化合物提取量为响应值，具体因素水平及编码值见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素和编码值

1.3.6 抗氧化性

1.3.6.1 DPPH自由基清除率

参考孙雪婷等[11]方法适当修改，具体如下：将不同浓度的藜麦黄酮类化合物提取液0.1 mL加去离子水0.3 mL，再加0.2 mL的0.02% DPPH乙醇液，混匀后在室温下避光放置60 min，去离子水调零，测定在517 nm下吸光度（A样品），样品对DPPH自由基清除率按照公式（2）计算。

式中：A对照用等体积去离子水代替样品；A样品空白用等体积无水乙醇代替0.02% DPPH乙醇液。

1.3.6.2 总抗氧化能力

采用总抗氧化能力测试盒进行测定，具体操作按照试剂盒说明进行，藜麦黄酮类化合物的总抗化能力以U/μg计。

2 结果与分析

2.1 超声辅助提取藜麦黄酮类化合物影响因素研究

由图2（a）可知，当藜麦粉碎孔径从0.250 mm增大到0.850 mm时，黄酮类化合物的提取量随着孔径的加大而急剧减小。粉碎筛的孔径越小，表示物料颗粒的粒径越小，所以与溶剂接触表面积越大，进而溶剂进入到物料内部的扩散路径越短，加上超声辅助浸提对细胞壁的破碎作用，因此粉碎筛的孔径越小越有利于黄酮类化合物的快速溶出[12]。当藜麦粉碎孔径小于0.250 mm提取的黄酮类化合物含量趋于平稳，说明继续减小粉碎孔径并不能进一步提高黄酮类化合物浸出，推测与超声快速破壁有关。此外，粉碎过细则固体过小，会加大后续过滤处理难度。因此，超声辅助提取藜麦黄酮类化合物要选择合适的粉碎孔径大小。

从图2（b）可以看出，料液比由1∶25 g/mL增大到1∶50 g/mL时，藜麦黄酮类化合物的提取量由3 mg/g提高到7 mg/g。在较低料液比时，加水量少导致藜麦颗粒与水接触得不充分，结果部分黄酮类化合物不能及时溶出，造成提取量降低。当料液比在1∶50～1∶150 g/mL范围时，藜麦黄酮类化合物的提取量保持在7 mg/g左右，表明藜麦黄酮类化合物已基本提取完全，而料液比过大则不利于提取液的浓缩。

图2 超声辅助浸提条件对藜麦黄酮类化合物的提取量影响

由图2（c）可知，当超声提取温度在室温（24 ℃左右）到40 ℃时，藜麦黄酮类化合物的提取量维持在5.50 mg/g左右。之后，超声提取温度为40～60 ℃时，藜麦黄酮类化合物的提取量开始缓慢地增加。当超声提取温度从60 ℃提高到70 ℃时，黄酮类化合物的提取量随着提取温度的增高而急剧地增加，其中70 ℃下的藜麦黄酮类化合物的提取量达到9.85 mg/g。浸提温度提高有助于增加黄酮类分子能量，促进其氢键和疏水键断裂，加大黄酮类分子和溶剂分子碰撞机率，从而快速提高其溶出速度[13]。但是，当超声提取温度大于70 ℃时，黄酮类化合物的提取量出现明显的下降趋势，推测与提取温度过高导致目标产物结构被破坏，或黄酮类化合物物在较高温度下发生分解和转化有关[14]。

图2（d）结果显示，在超声提取时间为0～30 min时，藜麦黄酮类化合物的提取量随着时间的延长而增加，说明适当延长超声时间有利于藜麦颗粒与水充分接触和超声破壁效应，有利于黄酮类化合物的溶出，其中超声提取30 min时，藜麦黄酮类化合物的提取量达到11.00 mg/g。之后，延长超声提取时间（＞30 min），黄酮类化合物提取量又出现大幅度的下降，随后趋于平缓，推测可能与超声处理时间过长导致热效应增加，促使已浸提出来的黄酮类化合物发生部分降解有关。

2.2 响应面法优化超声辅助提取藜麦黄酮类化合物工艺条件

在单因素试验基础上，选择对藜麦黄酮类化合物提取量影响大的藜麦粉碎孔径、超声提取温度和超声提取时间进行三因素三水平Box-Behnken响应面分析试验，以藜麦黄酮类化合物的提取量为响应值，具体试验设计及结果见表2。

表2 Box-Behnken试验设计及结果

对表2结果进行二次多项式回归方程分析，确定Y（黄酮类化合物提取量）与A（粉碎孔径）、B（超声提取温度）和C关系为：Y=11.718 75+0.225 4A-0.144 425B-0.063 857 5C-0.007 375AB+0.011 15AC+0.000 325BC-0.000 267A2+0.004 857B2-0.001 942C2。根据回归方程中各项系数绝对值的大小和正负，可确定单因素对响应值的影响程度和影响方向[15]。由此可知，A（粉碎孔径）对响应值Y（黄酮类化合物提取量）有正向影响，而B（超声提取温度）和C（超声提取时间）则对藜麦黄酮类化合物的提取量有一定程度负影响。

对表2结果进行方差分析（见表3），其中模型p值0.004 6小于0.05，失拟项值0.057 5大于0.05，且模型R2=0.800 6，说明该试验模型有效可行，可用于预测超声辅助提取藜麦黄酮类化合物工艺条件。当p＜0.05表示因素对综合评分值有显著影响[16]，从表3可知，模型的一次项B和交互项AB和AC对响应值影响显著（p＜0.05），而模型的一次项A、C和交互项BC则对响应值影响不显著（p＞0.05）。

表3 响应面试验方差分析

进一步分析了粉碎孔径和超声提取温度（AB），粉碎孔径和超声提取时间（AC），超声提取温度和超声提取时间（BC）的交互作用对藜麦黄酮类化合物提取量的影响，结果如图3所示。

由图3（a）分析得：当粉碎孔径一定时，随着超声提取温度的升高，藜麦黄酮类化合物的提取量显著提高，说明超声提取温度对目标产物黄酮类化合物的提取量具有显著线性影响，即超声提取温度的升高可以促进黄酮类物质分子和溶剂分子碰撞，使得黄酮类化合物加速溶解，从而提高黄酮类化合物的提取量，但当粉碎孔径小于0.241 mm时，其影响并不明显，其原因可能是物料粒径较小，黄酮类化合物较快溶出，减弱超声温度对目标产物的提取作用。在一定的超声温度条件下，减小粉碎孔径对黄酮类化合物提取有促进作用，粒径减小，物料与提取液接触面积的增大，有利于溶剂充分提取藜麦黄酮类化合物。而当超声提取温度为75～80 ℃时，减小粉碎孔径对黄酮类化合物提取有减弱作用。

由图3（b）可知：在超声提取时间20～30 min时，超声提取时间一定，藜麦黄酮类化合物的提取量随粉碎孔径增大而增加；在超声提取时间为30～40 min时，随着粉碎孔径的增大，其提取量减少。当粉碎孔径为0.180～0.241 mm时，其提取量随着超声提取时间的延长而增加；当粉碎孔径为0.278～0.425 mm时，超声提取时间延长，其提取量显著减少。说明粉碎孔径与超声提取时间相互影响。

由图3（c）可以看出：当超声提取时间一定时，超声提取温度升高有利于提高藜麦黄酮类化合物提取量；当超声提取温度一定时，藜麦黄酮类化合物提取量随着超声提取时间的升高而下降，推测可能是由于超声提取时间过长，部分黄酮类化合物质不稳定而降解，导致藜麦黄酮类化合物提取量的下降。

图3 各因素交互作用对藜麦黄酮类化合物提取量的影响

经响应面分析确定，料液比为1∶100 g/mL条件下藜麦中黄酮类化合物的最优浸提条件为粉碎孔径0.425 mm、超声提取温度80 ℃和超声提取20 min。经测定，该条件下藜麦黄酮类化合物提取量达到12.09 mg/g，与理论预期值12.13 mg/g非常接近，说明响应面优化确定的工艺条件可行。

2.3 藜麦黄酮类化合物的抗氧化性

2.3.1 DPPH自由基清除能力

由图4可知，藜麦黄酮类化合物对DPPH自由基清除具有典型的剂量依赖性，即清除率随着黄酮类化合物浓度的增加而增加。同样，水溶性抗氧化剂抗坏血酸对DPPH自由基清除也具有剂量依赖性。但在低质量浓度下，如0～4.0 μg/mL，藜麦黄酮类化合物对DPPH自由基清除能力略高于抗坏血酸。当质量浓度为24 μg/mL时，抗坏血酸对DPPH自由基清除率达到88%，藜麦黄酮类化合物的为72%，今后可以采用提高藜麦黄酮类化合物添加量方式提高其对DPPH自由基清除效果。

图4 藜麦黄酮类化合物与抗坏血酸对DPPH·的清除率

2.3.2 总抗氧化能力

与清除DPPH自由基结果相似，藜麦黄酮类化合物和抗坏血酸的总抗氧化能力均表现出随着浓度的增加而增大变化趋势，且相同浓度下两者抗氧化能力较为接近。当质量浓度达到24 μg/mL时，藜麦黄酮类化合物的总抗氧化能力可达0.62 U/μg，抗坏血酸达0.68 U/μg，两者总抗氧化能力接近。但是，藜麦黄酮提取液还含有其他水溶性成分，如蛋白质、肽、糖类等，因此藜麦黄酮提取液有作为营养型抗氧化剂应用前景。

图5 藜麦黄酮类化合物与抗坏血酸的总抗氧能力

3 结论

在料液比1∶100 g/mL条件下，响应面试验优化得到超声辅助提取藜麦黄酮类化合物的最佳工艺条件为藜麦粉碎孔径0.425 mm，超声提取温度80 ℃和超声提取时间20 min，该条件下藜麦黄酮类化合物的提取量达到12.09 mg/g。经测定提取的藜麦黄酮类化合物对DPPH自由基清除效果和总氧化能力与水溶型抗氧剂抗坏血酸能力较为接近，为藜麦资源深度开发利用提供一定技术依据。