易通过冷冻食品传播的新冠病毒解旋酶的表达纯化及酶活研究

李海红，郑亚婷，高 博，韩晓睿，何怡宁， 侯锡苗

（西北农林科技大学生命科学学院生物化学与分子生物学教研室，陕西 杨凌 712100）

2019年12月下旬爆发的新型冠状病毒（SARSCoV-2）导致了冠状病毒疾病COVID-19，SARSCoV-2被世界卫生组织报道成为全球范围内的大爆发，它的持续爆发已经给世界各地的人类生命和经济造成了巨大损失。随着近期全国多地的海关部门在冷冻食品中发现新冠病毒，此前武汉、北京、大连等多地的农贸及海鲜市场都曾检测到新冠病毒，这表明新冠病毒对人类食品安全产生重大的威胁。

冠状病毒属（Coronavirus）在系统分类上属于套式病毒目（Nidovirales）冠状病毒科（Coronaviridae）[1]。冠状病毒属的基因组为线性单股正链RNA，基因组全长26-31kb，是目前已知RNA病毒中基因组最大的病毒[2]，其基因组编码16种非结构蛋白，命名为Nsp1-Nsp16[3]，其中RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP）、RNA解旋酶（Nsp13）及复制辅助因子（Nsp7、Nsp8）组装成高效的RNA合成机器，该RNA复制体是病毒存活的核心部件，对病毒复制至关重要[4]。

由于Nsp13在所有冠状病毒物种中的高度保守性，被作为理想的抗病毒靶点[5-7]。有研究表明，SARS-CoV的Nsp13，具有NTP水解活性[8]，可以水解所有类型的NTP，以NTP依赖的方式解开双链DNA和RNA，解旋的极性是5'-3'[9]。尽管是RNA解旋酶，但是Nsp13大约以相同的速率解旋RNA和DNA底物[10]。与其他解旋酶相比，Nsp13解旋酶的解旋效率较低，但可能通过不同的机制增强，如通过协同作用或者与病毒的RdRp相互作用[11-12]，除解旋酶活性外，Nsp13被认为还具有RNA-5'-三磷酸酶活性，该活性可能在mRNA加帽中发挥作用。有研究表明，SARS-CoV-2的Nsp13解旋酶具有解旋DNA、RNA双链的作用[9]。

研究表达并纯化了高纯度的SARS-CoV-2-Nsp13蛋白，对其与RNA和DNA底物的结合及解旋双链DNA的能力进行了探究，研究结果可为理解SARSCoV-2的复制机理提供参考和支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料

质粒与菌株pET21a-HMT表达载体和大肠杆菌菌株2984、BL21（DE3），均为实验室保存。

1.1.2 试剂及仪器

Buffer A：25 mmol/L Tris-HCl溶液pH值8.0，500 mmol/L NaCl，5mmol/L咪唑；新冠病毒（SARSCoV-2）Nsp13蛋 白 编 码 序 列（SARS-CoV-2-Nsp13），Bio Matik公司提供；限制性内切酶EcoRI和XhoI，Takara公司提供；Ni-NTA Resin，QIAGEN公司提供；Heparin柱，GE Healthcare公司提供。

高压破碎仪，JNBIO公司产品；AKTA purifier型蛋白纯化仪，GE Healthcare公司产品。

1.1.3 DNA底物

寡聚核酸链，生工生物工程（上海）股份有限公司提供。结合试验及解旋试验的底物标记有荧光素（Fluorescein，F）。底物的退火方式为寡聚核酸链按照摩尔比为1∶1的比例混合，95℃下加热5 min，然后缓慢降至室温。

结合及解旋试验中所用的DNA底物见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 载体构建及蛋白质的表达与纯化

产物经EcoR I和Xho I酶切后，连入pET-21a-HMT载体中，重组质粒经酶切鉴定及测序确认无误后，转入BL21（DE3）表达菌株进行蛋白质表达。37℃下培养至菌液吸光度A600约为0.6 h，加入终浓度为0.3 mmol/L的IPTG（Merck），18℃下诱导16 h，收集菌体。用缓冲液悬浮菌体，并用高压细胞破碎仪破碎菌体。高速离心收集上清后，先利用Amylose亲和层析柱进行初步纯化，使用Elute Buffer（25 mmol/L Tris-HCl pH值8.0，200 mmol/L NaCl，5% Glycerol，0.5% Maltose）洗脱后，蛋白洗脱液稀释降盐后再利用Heparin Sepharose Fast Flow亲和层析柱进一步纯化。纯化产物通过10% SDS-PAGE检测纯度，合并较纯组分并使用30 kD的Millipore超滤管离心浓缩，分装后立即用液氮速冻，保存于-80℃下备用。

1.2.2 SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶的DNA、RNA结合活性测定

利用荧光偏振原理，测定SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶与单荧光标记底物发生结合反应时的荧光各向异性的变化。反应体系150μL，其中荧光标记的DNA浓度为5 nmol/L，SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶的浓度依次增加，缓冲液成分为25 mmol/L Tris pH值8.0，50 mmol/L NaCl，2 mmol/L DTT，置于96孔黑色微孔板中，37℃孵育5 min后，使反应体系达到平衡状态，之后利用Infinite F200Pro型多功能酶标仪（TECAN）测定每一个反应体系的荧光各向异性值。所有试验均重复3次。用公式（1）对数据进行拟合，计算平衡解离常数。

式中：Δrmax——测得的最高各向异性值（Δrmax=rmax,complex-rfree,DNA）；

Δr——测得的荧光各向异性值；

Kd——平衡解离常数；

P——蛋白质的浓度，mmol/L；

n——希尔系数。

1.2.3 利用Electrophoretic Mobility Shift Assay（EMSA）方法测定SARS-CoV-2-Nsp13解旋dsDNA

将3 nmol SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶和40 pmol荧光标记的退火后双链DNA底物5'OhS14D12加入到25 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0），50 mmol/L Na-Cl，10 mmol/L MgCl2，2 mmol/L DTT中，反应体系10μL，37℃孵育30 min，反应被5×loading buffer终止（100 mmol/L Tris-HCl，1% SDS，50% Glycerol，and Bromophenol blue（pH值7.5）），待反应结束后，以上混合物进行10% Native-PAGE电泳后，并使用ChemiDoc MP拍照分析试验结果（BIO-RAD，USA）。

2 结果与分析

2.1 SARS-CoV-2-Nsp13表达载体的构建

重组pET21a-HMT-Nsp13的质粒图谱及EcoRI、XhoI双酶切检测见图1。

图1 重组pET21a-HMT-Nsp13的质粒图谱及EcoRI、XhoI双酶切检测

基因片段的前端依次连接有6×His标签和Maltose-binding protein（MBP）促溶标签。重组载体经EcoRI、XhoI双酶切后出现了目的蛋白片段（约1.9 kb）（见图1（b）），并通过测序确认无误。

2.2 重组SARS-CoV-2-Nsp13的表达与纯化

将鉴定正确的重组载体转化到E.coli BL21(DE3)中，18℃下诱导表达16 h，目的蛋白在破菌后的上清中有比较明显的表达。经Ni-NTA亲和层析纯化可获得大量目的蛋白。

SARS-CoV-2-Nsp13蛋白的表达纯化见图2。

（图2（a）泳道5-7）；再利用Heparin柱梯度洗脱得到较纯的SARS-CoV-2-Nsp13蛋白（图2（b）泳道1-7）；最终浓缩得到SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶（图2（c）），大小约107 kD，与理论值相符。

图2 SARS-CoV-2-Nsp13蛋白的表达纯化

2.3 SARS-CoV-2-Nsp13的结合活力测定

利用荧光偏振原理，检测SARS-CoV-2-Nsp13与单荧光标记底物发生结合反应时的荧光各向异性的变化。不同浓度的SARS-CoV-2-Nsp13依次加入到150μL包含有5 nmol/L底物的缓冲液中，缓冲液成分为25 mmol/L Tris-HCl pH值7.5，20 mmol/L NaCl，2 mmol/L DTT。结果表明，随着SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶浓度的增加，其结合ssDNA-18nt、5'OhS12D20、5'RNA HP-12nt12bp底物的各向异性呈S型曲线上升趋势（图3（a）），SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶结合单链DNA、带有5'尾链的双链DNA及RNA发卡结构的活力具有差异性，通过希尔方程拟合，得到SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶结合ssDNA-18nt、5'OhS12D20、5'RNA HP-12nt12bp的Kd值依次是0.720 99±0.036，0.366 9±0.018，0.393 36±0.02μmol/L，由Kd值可知，解旋酶与不同底物的结合活性强弱依次为5'OhS12D20＞5'RNA HP-12nt12bp＞ssDNA-18nt（图3（b））。

SARS-CoV-2-Nsp13与不同底物的结合活性见图3。

2.4 SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶解旋活性的研究

由图3（a）可知，在试验条件下，当SARSCoV-2-Nsp13蛋白浓度在0.5~2.0μmol/L变化时，只能解开一部分双链DNA，当SARS-CoV-2-Nsp13蛋白浓度达到3μmol/L时，其解旋完全，解旋活性随着蛋白浓度的升高而增强，因此确定SARSCoV-2-Nsp13解旋酶浓度为3μmol/L时可以完全解开DNA双链。由图3（b）可知，在试验条件下，反应buffer中NaCl的浓度为80 mmol/L时，SARSCoV-2-Nsp13蛋白解旋DNA双链的活力受到较为明显的抑制，NaCl浓度30 mmol/L和50 mmol/L时，解旋活力相当，考虑到底物的稳定性，将解旋的NaCl浓度确定为50 mmol/L。

图3 SARS-CoV-2-Nsp13与不同底物的结合活性

利用凝胶阻滞试验对SARS-CoV-2-Nsp13蛋白解旋双链DNA的活性研究见图4。

图4 利用凝胶阻滞试验对SARS-CoV-2-Nsp13蛋白解旋双链DNA的活性研究

3 结论

研究了新冠病毒Nsp13解旋酶的体外生化活性，结果表明，该解旋酶具有与单链DNA、带有5'尾链的双链DNA及RNA发卡结构结合的活性；具有解旋带有5'尾链的双链DNA的活力，解旋的方向是5'-3'，且解旋活力受到NaCl的抑制。

新型冠状病毒疫情已成为人类健康和生命的重大威胁。冠状病毒编码的RNA解旋酶是病毒复制复合体的重要组成部分，在病毒的传播和感染中起到不可或缺的作用。因此，冠状病毒编码的RNA解旋酶被认为是理想的抗病毒靶点。研究利用原核表达系统纯化了新冠病毒的解旋酶Nsp13。试验测定了SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶与不同DNA及RNA底物的结合活性，发现其结合带有5'尾链的双链DNA及RNA发卡结构的活力要强于单链DNA，这表明SARS-CoV-2-Nsp13在病毒的转录和复制中发挥重要作用。通过希尔方程拟合，拟合曲线是S型，3个底物的n值均大于1，结果表明底物与SARSCoV-2-Nsp13的结合存在协同作用，这与先前文献中研究一致[10]。SARS-CoV-2-Nsp13对于5'端存在尾链的双链DNA和RNA发卡高的亲和力是其能够解旋双链DNA和RNA的保证。EMSA试验表明，SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶具有解旋DNA双链的活力，解旋的方向是从5'-3'，解旋的最适蛋白浓度为3μmol/L，解旋反应中高的NaCl浓度会抑制SARSCoV-2-Nsp13解旋双链DNA的活力。

试验结果表明，SARS-CoV-2-Nsp13解旋DNA双链沿着5'-3'方向进行，而且需要DNA双链的5'端带有尾链，这与之前报道的SARS-CoV-Nsp13一致。不同的是Jia Z等人[11]报道SARS-CoV-Nsp13解旋酶可以解旋15 bp长度双链DNA，比试验结果稍长一些，可能的原因是试验中所使用的底物序列不同，另外Jia Z等人[11]的解旋反应体系中加入了DNA trap，这可能在一定程度上有利于解旋。

研究进一步拓展了对新型冠状病毒复制体的理解，对新型冠状病毒解旋酶Nsp13可作为抗病毒药物研发中一个有价值的靶点提供了试验支持，从而有助于新冠疫情的防控和医治。