alg3、vps1301、rad51基因缺失对粟酒裂殖酵母接合生殖的影响

白鑫，丁祥，李慧，杨彤，陈茜，侯怡铃

(1.西华师范大学 生命科学学院 ，西南野生动植物资源保护教育部重点实验室，四川 南充 637009；2.西华师范大学 环境科学与工程学院，四川 南充 637009)

粟酒裂殖酵母是用于研究细胞周期和细胞形态的重要生物模型[1]. 细胞分裂是所有生物的基本特征.酵母有丝分裂通过产生与母细胞遗传倍数相同的2个子细胞来实现细胞更新和扩增，酵母减数分裂通过产生4个遗传倍数减半的配子促进物种间的遗传交叉[2].在粟酒裂殖酵母的生长周期中，这2个过程的顺利进行对于粟酒裂殖酵母的生长至关重要.而酵母细胞的生长和接合生殖受诸多基因影响，其中任何一个基因的异常都可能导致其生命活动的严重变化.如tom70基因缺失会导致细胞生长缓慢[3]，并且会降低交配率[4].

alg3基因位于粟酒裂殖酵母Ⅱ号染色体，基因ID为SPAC7D4.06c，基因坐标为NC_001134.8：69751-71127.alg3基因为1 867 nt长的基因片段，其中编码区长为1 221 nt(图1a).alg3基因编码甘露糖基转移酶，该酶的蛋白结构为一个单体，无配体(图1d).研究发现该酶直接参与酵母中脂质连接的寡糖的生物合成，而不是以辅酶的身份[5].对于细胞内蛋白质N-糖基化的正常进行有着重要意义.

vps1301又名vps13a，基因ID为SPBC31F10.18c，基因长度为9 886 nt，其中编码区长为9 318 nt，是位于粟酒裂殖酵母Ⅱ号染色体的基因，基因坐标为NC_003423.3:3787901-3799764(图1b).vps1301基因编码的蛋白是与液泡蛋白分选相关蛋白，该蛋白结构是一个同源二聚体，无配体(图1e).

a.alg3基因位置; b.vps1301基因位置; c.rad51基因位置; d.Alg3蛋白结构; e.Vps1301蛋白结构; f.Rad51蛋白结构.图1 alg3、vps1301、rad51基因位置及其表达蛋白结构Fig.1 Gene location map of alg3, vps1301, rad51 gene and the structure of the proteins

rad51基因位于粟酒裂殖酵母V号染色体，基因ID为SPAC644.14c，为2 174 nt长的基因，其中编码序列长1 098 nt，其坐标为NC_001137.3:349860-351302(图1c).rad51基因编码的是低等真核生物中的有效重组酶Rad51，该蛋白结构(图1f)为同源二聚体，无配体.Rad51和Dmc1的DNA链交换活性最有可能对低等真核生物的正确减数分裂DNA双链断裂修复至关重要[6].

目前，关于上述3种基因(alg3、vps1301、rad51)缺失对于粟酒裂殖酵母的生长和接合生殖的影响研究还未见报道.因此，本次研究选取alg3、vps1301、rad51为研究对象，拟探究粟酒裂殖酵母缺失上述3种基因对其生长和接合生殖的影响，为后续进行基因缺失对于粟酒裂殖酵母的影响机制研究提供参考.

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

1.1.1 实验材料

本实验所用菌株以及所构建的菌株见表1.

表1 实验菌株编号及基因型

本实验所使用的粟酒裂殖酵母菌种均来自于西南野生动植物资源保护教育部重点实验室，用甘油法保存于-80 ℃冰箱[7].

1.1.2 实验所需培养基及试剂配制

实验所需培养基均参考文献[8]的方法配制.YE5S液体培养基、YE5S固体培养基、EMM-N产孢培养基均购自生物风资源技术服务公司，G418筛选培养基购自赛国生物科技有限责任公司. 本实验所使用的氨基酸、嘌呤、嘧啶均购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；酵母提取物、琼脂、葡萄糖均购自Thermo Fisher Scientific 公司.

100×蜗牛酶Buffer：称取18.29 g山梨醇(上海麦克林生化科技有限公司)、4.21 g EDTA(上海麦克林生化科技有限公司)、0.109 gβ-巯基乙醇(西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司)，溶于100 mL无菌水，于0.1 MP、121 ℃湿热灭菌20 min，待其冷却后密封保存于4 ℃冰箱.使用时用无菌水稀释至1倍.

蜗牛酶：使用前用1×蜗牛酶Buffer将蜗牛酶(上海源叶生物科技有限公司)稀释至1 mg/mL.

1.2 实验方法

1.2.1 生长曲线的测定

1.2.1.1 冻存酵母的活化

将-80 ℃条件下冻存的酵母菌种接种在YE5S固体培养基上，于25 ℃恒温培养箱(DPX-9272B-1，上海福玛实验设备有限公司)培养3 d.取适量酵母于YE5S液体培养基，混匀，置于25 ℃恒温振荡器(THZ-Q，上海百典仪器设备有限公司)培养12 h.

1.2.1.2 生长曲线的绘制

将活化后的野生型和3种突变株用YE5S液体培养基分别稀释至OD595为0.1左右，测4次OD595值.在25 ℃恒温振荡器中培养.每2 h测1次OD595值，每次重复测4次.同时将YE5S液体培养基作为空白组，测4次OD595值.连续培养12 h，共测7次.重复做3次.将测得的OD595值减去空白组的OD595值得到实际酵母OD595值.分别以培养时间和实际OD595值为横纵坐标绘制折线图.

在25 ℃条件下，在100×显微镜(BX51，奥林巴斯(中国)有限公司)下截取活化后的野生型和上述3种基因缺失菌株的细胞图像，并统计细胞的长度和宽度.本研究每种菌株每组截取20个细胞图像，共3组，共计60个细胞，分别测量其长度和宽度，计算长宽比，并分析其长度和宽度的拟合斜率.

将上述用YE5S液体培养基活化后的4种菌株(野生型、alg3Δ、vps1301Δ、rad51Δ)调OD595至0.1，吸取20 μL，悬空3 cm滴在YE5S固体培养基上，每隔10 h拍照记录，总时长50 h，在100×显微镜下截取菌落形态图像.

1.2.2 突变株和野生型菌株孢子形态观察与分析

1.2.2.1 突变株异性菌株的分离

将突变株分别与野生型h+菌和野生型h-菌在EMM-N培养基上混合均匀后培养2 d，镜检是否产孢，以确定突变株正负性.将确定正负性的突变株分别与异性的野生型混合，于EMM-N培养基上培养48 h.取适量的菌体放入1.5 mL EP管，再加入1 mL 1 mg/mL蜗牛酶，混匀，用封口膜包裹，室温下放置7 d.用无菌水清洗3次，得到孢子混合液.取适量孢子混合液均匀涂布于G418培养基上，于25 ℃恒温培养箱培养7 d.选取单个菌落在YE5S固体培养基上划线培养，挑出单克隆(20个左右)并扩大培养.将扩大培养的20个菌株分别与最开始的已知正负性突变株混合，接种在EMM-N培养基上，2 d后镜检，以确定是否为其异性菌株.将突变株正负菌株都用YE5S固体培养基扩大培养，并进行纯化，再使用甘油法保存菌种[5].

1.2.2.2 孢子形态观察与分析

将野生型酵母接合生殖产孢作为对照组，以基因缺失菌株接合生殖产孢作为实验组，将活化后的突变株的正负菌株和野生型分别混合，接种在EMM-N培养基上，在25 ℃恒温培养箱培养2 d.

在100×显微镜下观察并截取酵母菌产孢图像.把野生型和3种基因缺失菌株中产孢数目不同的菌株分别统计，统计3组，每组50个共计150个细胞，取平均值并计算标准差.再将3种基因缺失菌株的产孢数目分别和野生型菌株产孢数目做柱状图，加入标准差,并用IBM SPSS statistics 23分析产孢数目差异显著性.

测量上述实验所截取的产孢图像中的孢子长度，野生型和3种基因缺失菌株分别统计3组，每组20个孢子，共计60个孢子的长度.将上述数据整合，用IBM SPSS statistics 23分析其差异显著性.将3种基因缺失菌株的孢子长度和野生型菌株孢子长度做箱式图，加入标准差.

2 结果和分析

2.1 野生型及基因缺失菌株在25 ℃条件下的生长曲线及菌落形态

野生型和基因缺失菌株在25 ℃条件下生长曲线和菌落形态如图2所示.

图2 野生型(WT)和alg3Δ、vps1301Δ、rad51Δ菌株在25 ℃的生长曲线(a)和菌落形态(b)Fig.2 Growth curve (a) and colony morphology (b) of wild-type (WT), alg3Δ, vps1301Δ and rad51Δ strains at 25 ℃

图2a显示，在25 ℃条件下：

0～6 h，野生型菌株，alg3Δ菌株，vps1301Δ菌株和rad51Δ菌株的平均生长速度分别为0.021 0、0.003 8、0.011 3 、0.014 3 OD595/h.在开始的6 h中，基因缺失菌株的平均生长速度均低于野生型菌株，其中alg3Δ菌株的平均生长速度最慢，约为野生型菌株的1/5；其次是vps1301Δ菌株，其平均生长速度约为野生型的1/2；而rad51Δ菌株的生长速度与野生型差异较小.

6～12 h，野生型菌株、alg3Δ菌株、vps1301Δ菌株和rad51Δ菌株平均生长速度分别为0.064 0、0.015 9、0.027 2 、0.059 4 OD595/h，6～12 h菌株进入对数生长期，生长速度明显加快.alg3Δ菌株的平均生长速度略有增加，但仍然为最慢，约为野生型菌株的1/4；而vps1301Δ菌株的平均生长速度依然为野生型的1/2；rad51Δ菌株的生长速度与野生型差距较小.

0～12 h，野生型菌株、alg3Δ菌株、vps1301Δ菌株和rad51Δ菌株的平均生长速度为0.042 5、0.009 8、0.019 3 、0.036 9 OD595/h，菌株的整体生长速度放慢，alg3Δ菌株的平均生长速度保持为野生型的1/4；vps1301Δ菌株的平均生长速度约为野生型的1/2；而rad51Δ菌株的生长速度与野生型差异较小.

由图2b可知，截至20 h,alg3Δ菌株的菌落较野生型生长最慢，其余菌株生长情况与野生型无明显差别.

综上分析显示，alg3基因缺失对于粟酒裂殖酵母的生长速度影响最大,其次是vps1301基因,rad51基因缺失对于粟酒裂殖酵母的生长速度影响最小.

2.2 野生型及基因缺失菌株在25 ℃条件下的细胞形态

细胞长度、宽度、长宽比及细胞形态如图3所示.

d1. 野生型菌株细胞；d2. rad51Δ菌株细胞；d3. vps1301Δ菌株细胞；d4. alg3Δ菌株细胞.* P <0.05，表示显著差异；** P <0.01，表示极显著差异.图3 野生型(WT)和alg3Δ、vps1301Δ、rad51Δ菌株在25 ℃的细胞长度(a)、宽度(b)、长宽比(c)和细胞形态(d)Fig.3 Cell length (a), width (b), aspect ratio (c) and cell morphology (d) of wild-type (WT), alg3Δ, vps1301Δ and rad51Δ strains at 25 ℃

本实验结果显示，野生型和alg3Δ、vps1301Δ、rad51Δ菌株的细胞平均长度分别是5.44 、5.55、6.22 、6.54 μm，细胞平均宽度分别为3.23、3.81、3.86、4.02 μm，细胞长度和宽度比值的拟合斜率分别为0.231 8、0.858 2、1.053 1、0.571 0.

通过分析发现，3种基因缺失菌株的细胞长度和宽度与野生型均无显著差异性.值得注意的是，对比野生型和基因缺失菌株的细胞长宽拟合斜率，alg3Δ、vps1301Δ、rad51Δ基因缺失菌株的细胞长宽比总是比野生型大，其中vps1301Δ的拟合斜率最大，其次是alg3Δ菌株，最后是rad51Δ菌株，该结果提示基因缺失菌株的细胞形态整体偏狭长.

2.3 野生型及基因缺失菌株在25 ℃条件下的产孢情况

2.3.1 产孢数目

野生型菌株和基因缺失菌株在25 ℃的孢子图像及产孢数目如图4所示.

a1. 野生型产孢数为4个的图像; a2、a3、a4. rad51Δ菌株产孢数为6、4、3个的图像; a5、a6、a7. vps1301Δ菌株产孢数分别为7、4、3个的图像; a8、a9、a10、a11. alg3Δ菌株产孢数分别为6、4、3、2个的图像.* P<0.05，表示显著差异，** P<0.01，表示极显著差异.图4 野生型(WT)和alg3Δ、vps1301Δ、rad51Δ菌株在25 ℃的孢子形态(a)及产孢数目(b)Fig.4 Spore morphology (a) and sporulation statistics (b) of wild-type (WT), alg3Δ, vps1301Δ and rad51Δ strains at 25 ℃

由图4可知，野生型产孢数目均为4个，其中，alg3Δ菌株产孢数目为2、3、4、6个，所占比列分别为0.67%、2%、96%、1.33%，统计学分析显示alg3Δ菌株与野生型产孢表现出显著差异(P< 0.05).vps1301Δ菌株产孢数目为3、4、7个，所占比列分别为0.67%、98.67%、0.67%，统计学分析显示，与野生型相比未表现出显著性差异.rad51Δ菌株产孢数目分别为3、4、6个，占比分别为2%、96.67%、1.33%，与野生型产孢数目相比，亦未表现出显著差异性.

以上实验结果显示，alg3基因缺失对于粟酒裂殖酵母的接合生殖影响最大，其次是rad51基因，vps1301基因对于粟酒裂殖酵母的接合生殖影响最小.

2.3.2 孢子长度

野生型和3种基因缺失菌株的孢子长度作箱式图，结果如图5所示.

图5 野生型(WT)和vps1301Δ、rad51Δ、alg3Δ菌株在25 ℃的孢子长度对比分析Fig.5 Comparison of spore length of wild-type (WT), vps1301Δ, rad51Δ and alg3Δ strains at 25 ℃

通过统计发现，野生型的平均孢子长度为2.53 μm，最大和最小孢子长度分别为3.51、1.79 μm.alg3Δ菌株的平均孢子长度为2.27 μm，最大和最小孢子长度分别为3.15、1.27 μm.vps1301Δ菌株的平均孢子长度2.31 μm，最大和最小孢子长度分别为2.91、1.55 μm.rad51Δ菌株的平均孢子长度分别为2.62 μm，最大和最小孢子长度分别为3.30、1.76 μm.

统计学分析发现，alg3Δ菌株的孢子长度与野生型孢子长度有极显著差异(P<0.01)，vps1301Δ菌株的孢子长度与野生型孢子长度也存在极显著差异(P<0.01)，而rad51Δ菌株的孢子长度与野生型孢子长度无明显差异.

3 讨论

alg3基因是粟酒裂殖酵母自身甘露糖基化的相关基因[9].该基因编码α-1，3-甘露糖基转移酶，它通过催化以α-1,3键连接的第1个磷酸多萜醇-P-β-D-甘露糖(Dol-P-Man)衍生的甘露糖与β-D-甘露糖-N-乙酰-PP-β-D-葡糖胺(Man(5)GlcNAc(2)-PP-Dol)的连接[9].有研究表明，粟酒裂殖酵母缺失alg3基因后，会导致β-D-甘露糖-N-乙酰-PP-β-D-葡糖胺的积累[5].本次研究发现，粟酒裂殖酵母缺失alg3基因后，粟酒裂殖酵母表现出生长速率明显变慢，产孢数量极其不稳定，孢子长度严重异常，表明alg3基因在细胞生长和接合生殖中都有非常重要作用.

Vps1301蛋白是第1个被表征为脂质转运蛋白的舞蹈症-N蛋白，这种蛋白不同于普通脂质运输蛋白，它能同时结合几十个脂质进行转运[10-11].有研究表明，Vps1301可以充当细胞器膜之间的桥梁，以允许大量脂质在细胞器之间流动[12].Vps1301蛋白是Vps13蛋白的重要成分，Vps13蛋白组可位于膜接触位点，包括核-液泡[13]、内质网(ER)-液泡[14]和内体-线粒体[15]等接触位点.有研究表明，Vps13蛋白家族在酵母孢子的生物发生中起重要作用[16].Vps13蛋白与人类的Vps13A是同源物，人类vps13a基因的突变是造成神经发育和衰退性疾病的原因，会引发舞蹈症棘皮细胞增多症[11].实验结果显示，vps1301基因缺失后，其生长和接合生殖都出现了不同程度的异常，比如产孢数目不稳定、孢子长度严重异常，表明vps1301基因对于粟酒裂殖酵母的生长有影响，对于其产孢有重要影响.

rad51基因编码Reca家族重组酶 Rad51.Rad51是修复性同源重组(HR)中的关键蛋白，一些辅助因子与Rad51蛋白酶相互作用可以促进生产性同源重组[17].rad51基因缺失将导致酵母HR过程被影响，DNA无法顺利被修复，生长和接合生殖都受到一定的影响.本实验结果显示，rad51基因缺失后，其生长和接合生殖都出现异常，比如产孢数目不稳定，表明rad51基因对细胞生长和接合生殖中都有影响.

本次研究首次探寻了粟酒裂殖酵母中alg3、vps1301、rad51基因对于粟酒裂殖酵母生长和接合生殖的影响，包括统计野生型粟酒裂殖酵母和基因缺失粟酒裂殖酵母的生长情况、细胞形态、产孢数量、孢子长度等数据，为alg3、vps1301、rad51基因缺失对粟酒裂殖酵母生长和接合生殖影响的研究提供了一定的科学依据，但其影响粟酒裂殖酵母生长和接合生殖的机制还有待进一步研究.